人參總皂苷增強成骨分化的間充質干細胞促造血作用研究

網絡出版時間：2014-12-4 13:45網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.011.html

人參總皂苷增強成骨分化的間充質干細胞促造血作用研究

尹利明1，趙燕娜1，杜文喜2，王瀟1，沃立科1，高瑞蘭1

(1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院血液病研究所，浙江 杭州310006;2.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院，浙江 杭州310053)

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R349.21

摘要:目的觀察人參總皂苷(TSPG)誘導間充質干細胞向成骨細胞分化的作用，探討TSPG增強成骨分化的間充質干細胞促造血的可能機制。方法貼壁法培養人源骨髓間充質干細胞(hMSCs)，成骨細胞分化和免疫表型進行鑒定。不同劑量的TSPG聯合成骨細胞條件誘導液培養hMSCs，MTT法檢測細胞增殖活性，對-硝基苯磷酸鹽(pNPP)法檢測培養上清堿性磷酸酶含量，茜素紅染色法觀察鈣結節數量，Western blot法檢測成骨細胞分化轉錄因子-核心結合蛋白因子2(RUNX2)蛋白表達水平，Elisa法檢測培養上清造血相關因子含量，造血祖細胞集落生成實驗檢測培養上清造血支持能力。結果MTT和pNPP結果均顯示隨著TSPG劑量增加，吸光值逐漸增加，呈劑量依賴性。鈣結節數量和RUNX2蛋白表達水平明顯高于對照組。造血相關生長因子和造血祖細胞集落數明顯高于對照組。結論TSPG通過上調RUNX2蛋白表達誘導hMSCs向成骨細胞分化，同時增強成骨分化的MSCs支持造血。

關鍵詞：人參總皂苷；間充質干細胞；成骨細胞；造血微環境；分化；造血

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.011

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0045-05

收稿日期:2014-09-17,修回日期:2014-10-27

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81202709 )；浙江省自然科學基金資助項目(No Y207728，LY14H290003)

作者簡介：尹利明(1977-)，男，博士，助理研究員，研究方向：中西醫結合血液病防治，E-mail:yinlm_hz@163.com;

Abstract:AimTo observe mesenchymal stem cell differentiation into osteoblast induced by TSPG， and explore how TSPG enhances the promotion of hematopoiesis of osteoblast differentiation from mesenchymal stem cell. MethodsMSCs were cultured by TSPG combined with osteoinductive medium. The cellular viability of proliferation was detected with MTT assay. The content of alkaline phosphatase in the cultural supernatant was tested with pNPP assay. The ability of MSCs to form calcium nodes was also observed after alizarin red stain. The protein expression of RUNX2 was analyzed with Western blot. The content of cytokines associated with hematopoiesis was tested with Elisa assay. The ability of promoting hematopoiesis was detected with hematopoietic colony forming assay. ResultsBoth MTT and pNPP assay showed that optical density (OD) values were increased in response to TSPG treatment in a dose-dependent manner. The mineralization formation ability was enhanced with TSPG-treatment. Meanwhile, the expression of RUNX2 protein was up-regulated in TSPG-treated cell. Moreover, the content of cytokines associated with hematopoiesis and the number of hematopoietic progenitor colony were increased by TSPG-treatment compared with the control group. ConclusionTSPG could induce MSCs differentiation in to osteoblast and enhance the effect of osteoblast differentiation from MSCs on promoting hematopoiesis.

高瑞蘭(1952-)，女，博士生導師，研究員，研究方向：中西醫結合血液病防治，E-mail:gaoruilan@163.com

我們前期實驗研究證明自行提取分離的人參總皂苷(TSPG)具有促造血的類生長因子樣效應[1-2]，研制成升血靈膠囊，1999年被浙江省衛生廳批準為醫院制劑。臨床應用15年，對慢性再生障礙性貧血(再障)的有效率為69.7%[3]，聯合環孢菌素A治療再障的有效率達83.3%[4]。前期實驗研究和臨床療效表明，TSPG具有一定程度的促造血功效，但其作用機制尚未明確。骨髓間充質干細胞是骨髓造血微環境的重要組成細胞，具有支持造血的作用，然而再障患者MSCs數量及成骨分化能力下降[5]，骨髓造血微環境受損甚至造血功能衰竭。近年研究表明促進MSCs增殖，提高成骨細胞分化能力，能夠改善再障骨髓造血微環境[6-7]。本文采用成骨分化的間充質干細胞作為支持造血的細胞模型，觀察TSPG誘導間充質干細胞向成骨細胞分化的能力及促造血作用，初步探討其相關機制。

1材料與方法

1.1材料低糖DMEM培養基購自美國Gibco公司，小牛血清(NBS)購自杭州四季青公司，PE標記CD31、CD49d和CD106以及FITC標記的CD44均購自美國BD公司，RUNX2抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司， GAPDH內參抗體購自聯科生物技術有限公司。人參總皂苷(TSPG)干燥粉劑由浙江中醫藥大學附屬第一醫院中藥制劑中心提供，批號：ZYB-0657-99，經高效液相色譜法分析其純度大于86%，用DMEM培養液水配制成1.0 g·L-1的儲存液，4℃保存備用。

1.2實驗方法

1.2.1hMSCs的分離、培養及純度鑒定經骨髓捐獻者同意進行以下實驗。肝素抗凝骨髓PBS倍比稀釋后，淋巴細胞分離液分離單個細胞層，含體積分數為0.10 NBS的DMEM培養液重懸細胞，并以2×105/cm2的密度接種于培養瓶。24 h后去除懸浮細胞，細胞融合達到85%后，胰酶消化傳代純化。流式細胞術檢測第三代細胞CD31、CD44、CD49d和CD106陽性的細胞率，礦化結節實驗檢測成骨細胞分化能力。

1.2.3MTT法對成骨分化的hMSCs增殖活性的檢測取第3代hMSC細胞接種于96孔板，1×104/孔，貼壁后，加入含不同濃度TSPG的成骨細胞誘導液。成骨細胞誘導液含L-DMEM、體積分數為0.10 NBS、10-8M·L-1地塞米松、10-2M·L-1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L-1抗壞血酸。72 h后， 每孔加入2.0×10-5L的MTT (5 g·L-1)，繼續培養4 h，吸棄培養上清，加入0.2×10-3L 的DMSO 溶解蘭色顆粒，490 nm波長處檢測吸光值(OD)。

1.2.4pNPP法檢測成骨分化的hMSCs堿性磷酸酶活性取第3代hMSC細胞接種于96孔板，1×104/孔，貼壁后加入含不同濃度TSPG的成骨細胞誘導液。培養3 d，吸棄培養上清，PBS洗滌兩次，加入0.2×10-3L 的pNPP液，室溫孵育30 min，以5.0×10-5L 的3 mol·L-1NaOH終止反應，405 nm波長處檢測吸光值(OD)。

1.2.5茜素紅染色法檢測鈣結節取第3代hMSC，接種于六孔板，2×105細胞/孔，細胞生長達60%～70%融合時，吸去培養上清，加入含TSPG的成骨細胞誘導液，每3 d換1次液。培養7 d。去培養液，PBS洗兩次，0.95的乙醇固定10 min，蒸餾水洗3次，加入質量濃度為1.0 g·L-1茜素紅，37℃染色30 min，去除染液，蒸餾水沖洗后，顯微鏡下觀察鈣結節。

1.2.6Western blot檢測成骨細胞分化相關蛋白表達水平取第3代hMSC，接種于六孔板，2×105細胞/孔，細胞生長達60%～70%融合時，吸棄培養上清，加入含TSPG的成骨細胞誘導液，每3 d換一次液。培養7 d，去培養液，PBS洗兩次。總蛋白提取參考文獻[8]，細胞裂解液(含50 mmol·L-1Tris，150 mmol·L-1NaCl，體積分數為0.1的 Triton X-100和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。將40 μg蛋白加入SDS凝膠加樣緩沖液20 μL中，煮沸后，經SDS-PAGE膠電泳分離后，將蛋白條帶用電轉移到NC膜(Amersham)上，分別加特異性RUNX2和內參抗體(sant cruze公司)，4℃孵育過夜，經洗滌加辣根過氧化物酶標記的二抗(Santa Cruz),室溫結合反應1 h，經洗滌ECL發光劑(Amersham)作用1min，采用灰度掃描系統測定并分析目的蛋白條帶。同樣實驗重復3次。

1.2.7收集不含TSPG的條件培養液取第3代hMSC，接種于六孔板，2×105細胞/孔，細胞生長達融合時，吸棄培養上清，絲裂霉素37℃預處理1 h，加入含TSPG的成骨細胞誘導液，培養3 d。去培養液，PBS洗兩次，加入不含血清的DMEM培養液，24 h后收集培養上清，該上清為成骨分化的hMSCs條件培養液，4℃保存備用。

1.2.8造血祖細胞集落培養檢測條件培養液造血支持能力取肝素抗凝骨髓，分離單個核細胞，加入含15%條件培養液的造血祖細胞集落培養體系。紅系祖細胞培養體系含體積分數為0.3的胎牛血清，2 U/mL重組人EPO，體積分數為0.1的植物血凝素-白細胞條件培養液，3 g·L-1瓊脂；CFU-E、BFU-E集落分別培養3、7 d。粒-單核系祖細胞培養體系含體積分數為0.3的胎牛血清，10 mg·L-1重組人GM-CSF，3 g·L-1瓊脂，培養7 d。培養體系均加入青霉素和鏈霉素各100 U/mL，造血生長因子購自Peprotech公司。接種于24孔培養板，1×105細胞/0.5 mL/孔，各樣品均為3復孔。置于37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中孵育。倒置顯微鏡下計數集落數的標準：CFU-E≥8個細胞，BFU-E≥40個細胞，CFU-GM≥40個細胞，該實驗重復3次

1.2.9Elisa法檢測條件培養液造血相關因子SCF、IL-6和GM-CSF含量按照Elisa試劑盒操作說明加檢測樣品，酶標儀波長490nm處讀OD值，通過標準曲線，計算條件培養液中SCF、IL-6和GM-CSF含量。

2結果

2.1骨髓間充質干細胞培養及鑒定人源骨髓有核細胞接種于培養瓶，培養3 d后倒置顯微鏡可見集落樣生長的貼壁細胞，7 d左右可融合為單層，形態不均一。經2～3次傳代純化細胞，形態均一(Fig 1A)。純化的細胞經成骨細胞條件培養液誘導，3～5 d 可見細胞梭形向多角形改變，并有聚集傾向，茜素紅染色可見礦化結節，培養7 d可見大量礦化結節(Fig 1B)。流式細胞儀測定第3代MSC細胞免疫表型，結果顯示免疫抗原CD31陽性細胞率為(0.89±0.12)%(Fig 1C)，CD44陽性細胞率為(97.6±4.3)%(Fig 1D)，CD49d陽性細胞率為(3.8±0.54)%(Fig 1E)；CD106陽性細胞率為(8.5±0.76)%(Fig 1F)。礦化結節形成和流式細胞術結果均提示通過貼壁和傳代的方法獲得純化的hMSCs，第3代細胞進行后續實驗。

2.2TSPG促進成骨分化的hMSCs增殖和分泌堿性磷酸酶成骨細胞誘導培養液中加入不同濃度TSPG， MTT法觀察細胞增殖活性； pNPP法觀察堿性磷酸酶分泌水平。MTT和pNPP結果均顯示隨著TSPG濃度升高OD值增加，并呈一定的濃度依賴性(Fig 2)。提示TSPG促進細胞增殖和堿性磷酸酶分泌。2.3TSPG促進礦化結節形成茜素紅染色法觀察礦化結節數量，結果顯示隨著TSPG濃度升高，礦化結節數量增加，TSPG處理組礦化結節數明顯高于未加藥的對照組(Fig 3)。2.4TSPG提高成骨細胞分化轉錄因子RUNX2蛋白的表達水平Western blot結果顯示，在12.5～50 mg·L-1濃度范圍，隨著TSPG濃度增加RUNX2蛋白表達水平逐漸增加，呈劑量依賴性(Fig 4)。

Fig 1Purification and identification of mesenchymal

stem cell from human bone marrow

A： purified hMSCs (200×)；B：calcium nodule differentiated from hMSCs(200×); C：CD31；D：CD44；E:CD49d；F:CD106.

2.5成骨分化的hMSCs條件培養液促進造血祖細胞生長造血祖細胞集落培養體系加入hMSCs/成骨細胞條件培養液， CFU-E，BFU-E和CFU-GM集落數(1×105有核細胞)分別為40.7±5.2，28.1±2.4和57.3±5.4，明顯高于未加條件培養液的對照30.2±4.1，19.4±2.1和42.2±4.6(P<0.05，0.01)。造血祖細胞集落培養體系加入25、50和100 mg·L-1TSPG 誘導的成骨細胞條件培養液，集落數均明顯增加，其中50 mg·L-1TSPG 誘導的條件培養液提高造血祖細胞集落生長的作用最明顯， CFU-E，BFU-E和CFU-GM集落提高率分別為(28.1±3.1)%，(32.3±2.7)%和(26.0±1.9)%明顯高于未經誘導的對照(P<0.05，0.01)(Fig 5)。2.6TSPG提高條件培養液中造血相關生長因子的含量Elisa結果顯示，成骨分化的hMSCs經不同濃度TSPG誘導，造血生長因子GM-CSF、IL-3和SCF在條件培養液的含量均有不同程度的提高(Fig 6)。

3討論

Fig 2　Effects of TSPG on cellular viability of

A:The cellular viability of proliferation was detected with MTT assay; B:The content of alkaline phosphatase in the cultural supernatant was tested with pNPP assay.*P<0.05，**P<0.01vscontrol (0 mg·L-1);#P<0.05vs12.5 mg·L-1.

Fig 3Effects of TSPG on the number of calcium nodule differentiated from mesenchymal stem cell

A:Control；B～E:TSPG 12.5，25，50，100 mg·L-1.

Fig 4　Effects of TSPG on the expression of RUNX2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol (0 mg·L-1)；#P<0.05vs50 mg·L-1.

Fig 5　Effects of TSPG treated conditioned medium on

*P<0.05，**P<0.01vsOCM+0 mg·L-1TSPG；*P<0.05vsOCM+12.5 mg·L-1TSPG.

近年研究報道，間充質干細胞分化的成骨細胞能夠調節造血干細胞增殖與分化，構成造血干細胞生長微環境[8-9]，間充質干細胞數量減少或成骨細胞分化能力下降將導致骨髓造血功能衰竭，如再障等。研究報道，再生障礙性貧血患者MSCs數量和分化潛能異常，主要表現為成骨細胞分化潛能下降，成骨細胞分化轉錄因子RUNX2表達低下，但是改善再障患者間充質干細胞分化異常藥物的報道尚少。本文TSPG干預成骨分化的hMSCs，觀察MSCs向成骨分化的能力，結果顯示成骨分化相關轉錄因

Fig 6　Effects of TSPG on the content of GM-CSF,IL-3 and

*P<0.05，**P<0.01vscontrol (0 mg·L-1);#P<0.05vs12.5 mg·L-1.

子RUNX2[10]高表達，且成骨相關鈣結節數量增加，提示TSPG體外能夠誘導MSCs向成骨細胞分化。

MSCs是骨髓造血微環境重要組成細胞，具有多向分化能力，其分化細胞對造血具有雙向調節作用。成骨分化的hMSCs分泌多種造血細胞生長所需細胞因子，如SCF、IL-3、GM-CSF等促進造血；脂肪分化的MSCs分泌多種造血負性調控因子抑制造血[11]。本文探討TSPG促MSCs成骨分化作用，同時觀察成骨分化的MSCs造血支持作用，結果顯示TSPG刺激成骨分化的MSCs分泌造血生長因子，促進造血祖細胞增殖。此外，研究報道造血生長因子參與調控MSCs向成骨細胞分化[12-13]。因此，提示TSPG具有改善造血微環境的作用。

綜上所述，TSPG能夠誘導hMSCs向成骨細胞分化，增強成骨分化的hMSCs細胞促造血作用，提示其能夠改善造血微環境，但尚需體內研究進一步證明。

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Total saponins of panax ginseng enhances the effect of osteoblast differentiation

from mesenchymal stem cell on promoting hematopoiesis

YIN Li-ming1, ZHAO Yan-na1, DU Wen-xi2, WANG Xiao1, WO Li-ke1, GAO Rui-lan1

(1.InstituteofHematology,theFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China;

2.theFirstSchoolofClinicalMedicine,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)

Key words: total saponins of panax ginseng; mesenchymal stem cell;osteoblast; hematopoietic microenvironment; differentiation; hematopoiesis