高山杜鵑組織培養中褐化控制的研究

朱小茜　齊婷婷

摘 要：為降低高山杜鵑組織培養中外植體的褐化程度，實驗對高山杜鵑組織培養中不同的外植體（頂芽、葉片、帶腋芽的莖段）、不同的基本培養基和不同的抗褐化劑等進行了研究。結果表明，高山杜鵑不同的外植體褐化率不同，其中帶腋芽的莖段的褐化率最低；活性炭對外植體褐變起到了很好的抑制作用，其中以添加1.0g/L的活性炭時外植體褐化率最低。

關鍵詞：高山杜鵑；組織培養；褐化；抗褐化劑

中圖分類號 S685 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）24-46-03

Abstract：To overcome the explants browning in tissue culture process of Rhododendron lapponicum，the different explants，different antioxidants and different basic mediums were tested in this study.The results indicated that the browning rate of different explant was different.Stem section with axillary buds had the lowest browning rate. Explants browning could be effectively prevented in the medium contained 1.0g/L activated carbon.

Key words：Rhododendron lapponicum；Tissue culture；Browning；Antioxidant

高山杜鵑（Rhododendron lapponicum）又名紅山茶，是杜鵑花科高山常綠灌木或小喬木植物，多生長在海拔較高的山地陰坡上，花朵有白色、粉色、紅色等多種顏色，色澤鮮艷，呈球形開放，作為禮品花和新興的年宵花卉，深受人們的喜愛[1]。但是高山杜鵑含有黃酮類化合物、多酚類物質，在組織培養時其外植體容易產生褐化現象，使其生長、分化受到抑制，甚至死亡[2]。為此，本實驗對高山杜鵑組織培養過程中褐化現象的控制進行了研究，以期為高山杜鵑組織培養提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試外植體材料采自安徽省霍山，取生長旺盛的高山杜鵑新生葉片、頂芽和帶腋芽的幼嫩莖段，用水沖洗掉表面灰塵。在超凈工作臺上用濃度為1‰的升汞消毒8min，無菌水漂洗4次。

1.2 試驗設計

1.2.1 不同外植體的褐化現象 外植體分別取新生葉片、頂芽、新梢上帶腋芽的莖段，切取為大小適中的小塊接種在1/4MS+TDZ0.2mg/L+IAA0.4mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L的培養基中培養，pH為5.5。葉片切成邊長為1～1.5cm的正方形，帶腋芽的莖段取大約1cm長。每種外植體接種20瓶，每瓶接入1個外植體，3次重復。

1.2.2 不同的基本培養基對高山杜鵑褐變的影響 切取長約1cm的帶腋芽的幼嫩莖段分別接種于以下4種基本培養基中：Read、MS、1/2MS、1/4MS，每一培養基中都添加TDZ0.2mg/L+IAA0.4mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH為5.5。每種培養基20瓶，每瓶接入1個帶腋芽的莖段，3次重復。

1.2.3 抗褐化劑對高山杜鵑褐變的抑制 在1/4MS+TDZ0.2mg/L+IAA0.4mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L培養基中分別添加不同的的抗褐化劑：活性炭（O.5，1，1.5g/L）、聚乙烯吡咯烷酮PVP（0.4，0.8，1.2g/L），pH為5.5。每種培養基20瓶，每瓶接入1個帶腋芽的莖段，3次重復。

1.2.4 培養條件 培養溫度：22～24℃；光照時間：11h/d；光照強度：2 500lx。

1.3 統計分析 每隔4d觀察并記錄外植體的褐化及生長情況，36d后對數據進行統計分析。相關計算公式如下：

褐化率（%）=（褐變的外植體總數/接種的外植體總數）×100；

增殖系數=增殖的芽總數/接種的外植體總數。

褐化程度采用目測法：“+”表示輕度褐化；“++”表示中度褐化；“+++”表示重度褐化。

2 結果與分析

2.1 不同外植體的褐化現象 高山杜鵑在組織培養時用不同材料作為外植體其褐化程度不同。從圖1可以看出，用新生葉片作為外植體時，20d后完全褐變，褐化率為100%，褐化程度非常嚴重，培養基表面產生了一種褐色物質；頂芽的褐變程度僅次之，其褐化率為73%；帶腋芽的幼嫩莖段褐化率為57%。接種后32d，頂芽褐化率上升至93%，帶腋芽的莖段的褐化率也增至80%。這是由于高山杜鵑新生葉片內含有很多酚類化合物，接種前又進行切割，傷口面積很大，培養過程中受傷細胞內的多酚類物質慢慢溢出，被氧化成褐色的醌類物質，這些醌類物質發生作用后使外植體蛋白質聚合，導致其死亡[3]。頂芽比帶腋芽的莖段褐化率高，這可能是由頂芽中含有的大量的多酚類物質和不同的內源激素共同作用的結果[4]。

2.2 不同基本培養基對高山杜鵑褐變的影響 高山杜鵑帶腋芽的莖段在不同基本培養基上其褐化程度不同。從圖2可以看出，外植體在1/4MS培養基上褐化率最低。4d后每種培養基中都開始出現褐化，并且褐化程度逐漸增強。接種24d后，1/4MS培養基中的褐化率達63%，褐化程度較輕，并且產生了少量的叢生芽，而1/2MS培養基中褐化率為83%，Read培養基的褐化率達到了90%，MS培養基中褐化率也高達87%，外植體褐變程度較嚴重。接種后32d，Read和MS培養基的褐化率增至100%，1/2MS中增至97%，1/4MS為80%。由此看出，植物細胞的褐化受基本培養基影響較大，培養基中含有高濃度的無機鹽，誘導外植體中酚類化合物大量溢出，進而加劇了外植體的褐化[5]。因此，降低培養基中無機鹽濃度可以抑制酚類物質的外溢，減緩褐變。

2.3 不同的抗褐化劑對高山杜鵑褐變的抑制作用 不同種類及不同濃度的抗褐化劑對高山杜鵑組織培養的抗褐化效果不同，結果如表1所示。從表1可以看出，活性炭（AC）對高山杜鵑外植體褐化有較強的抑制作用，在加入1.0g/LAC的培養基中褐化程度最輕。不加任何抗褐化劑時，32d后褐化率達到80%。添加0.5g/LAC的培養基中，其褐化率在32d后降至48%，褐變程度減輕，增殖系數為1.3。在添加1.0g/L活性炭時，32d后褐化率減至38%，褐化程度最輕，而且分化出了長勢良好的叢生芽，增殖系數為1.9。當添加AC的濃度增加為1.5g/L時，在組織培養早期褐變程度相對較輕，然而培養32d后褐化率增加為45%，增殖系數減少為1.5，叢生芽生長減緩。這是由于AC吸附性很強，高濃度的AC在吸附醌類等有毒物質的同時，也吸附了培養基的營養，從而阻礙了叢生芽的生長和分化[6]。AC能夠降低高山杜鵑組織培養的褐化率，但必須要選擇適宜的濃度。從表1還可以看出，培養基中添加了0.4～1.2g/LPVP，外植體褐變率達67%～75%，褐變程度稍有減輕，但增殖系數增加不明顯。本次實驗中PVP對高山杜鵑組培過程中褐變的抑制效果不顯著，這可能是由于PVP不能吸收高山杜鵑外植體中的一些多酚類物質及其衍生物。

3 討論與結論

3.1 不同外植體的褐化現象 高山杜鵑帶腋芽的莖段作為組織培養的外植體時褐化程度最輕；頂芽的褐化程度其次，新生葉片最嚴重，培養20d時褐化率即達100%。這可能與外植體的生長部位和面積有關。所以高山杜鵑組培快繁時盡量選用帶腋芽的幼嫩莖段。

3.2 不同基本培養基對高山杜鵑褐變的影響 實驗結果表明，高山杜鵑在MS培養基中褐變程度最嚴重，但在1/4MS培養基中褐化率最低。培養基中含有無機鹽濃度越高，外植體外溢的酚類物質越多，褐化越嚴重。因此將培養基中無機鹽含量適度降低，能有效減輕高山杜鵑外植體的褐化程度。

3.3 不同的抗褐化劑對高山杜鵑褐變的抑制 在培養基中添加不同的抗褐化劑都能一定程度地減輕高山杜鵑外植體的褐變。其中，以加入AC時抑制作用較顯著，其濃度為1.0g/L時效果最佳，褐化率減為38%，增殖系數最大，新生芽長勢良好。而添加0.4～1.2g/LPVP對高山杜鵑褐化的抑制作用不明顯。

參考文獻

[1]李志斌.高山杜鵑將成為我國高檔園林園林綠化的新秀[J].農業科技與信息，2007，19（7）：82-85.

[2]鐘國華，胡美英.杜鵑花科植物活性成分及作用機制研究進展[J].武漢植物學研究，2000，18（6）：509-514.

[3]沈海龍.植物組織培養[M].北京：中國林業出版社，2005.

[4]朱小茜.毛豹皮樟組織培養過程中褐化控制研究[J].安徽科技學院學報，2013，27（3）：33-36.

[5]梁巧玲，趙鵬.西洋杜鵑組織培養影響因素分析[J].江蘇農業科學，2010（2）：19.

[6]周艷，陳訓.活性炭在高山杜鵑組織培養中的應用[J].安徽農業科學，2008，36（4）：30. （責編：張宏民）