苦參堿通過下調STAT3信號通路抑制骨肉瘤Saos-2細胞增殖的實驗研究*

嚴小明　連福明　林智勤　張維

(1.福建醫科大學附屬三明第一醫院骨科， 福建 三明 365000;2.成都醫學院附屬第一醫院， 四川 成都 610500)

苦參堿通過下調STAT3信號通路抑制骨肉瘤Saos-2細胞增殖的實驗研究*

嚴小明1連福明1林智勤1張維2

(1.福建醫科大學附屬三明第一醫院骨科， 福建 三明 365000;2.成都醫學院附屬第一醫院， 四川 成都 610500)

【摘要】目的觀察苦參堿對成人骨肉瘤Saos-2細胞增殖的調節作用及其與STAT3活化水平的聯系。方法將成人骨肉瘤Saos-2細胞分為對照組(Control組)、低劑量苦參堿干預組(MAT-L干預組)及高劑量苦參堿干預組(MAT-H干預組)3組。使用MTT法對不同時間點(0、24和48h)各組Saos-2細胞活性進行檢測；使用qPCR對干預24小時后Saos-2細胞的survivin mRNA水平進行分析，使用western blot法對干預24小時后Saos-2細胞STAT3的活化水平及survivin蛋白表達水平進行分析。結果與對照組相比，給予苦參堿干預的Saos-2細胞活性呈時間依賴性和濃度依賴性下降，差異均有統計學意義(均P<0.05)；給予Saos-2細胞不同濃度的苦參堿干預24小時后，survivin mRNA和蛋白的表達水平及STAT3的活化水平呈濃度依賴性降低，差異均有顯著統計學意義(均P<0.05)。結論苦參堿可以通過下調STAT3的活化抑制成人骨肉瘤Saos-2細胞survivin的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖。該研究為苦參堿應用于骨肉瘤及其他惡性腫瘤的臨床治療提供了實驗基礎。

【關鍵詞】Saos-2細胞； 苦參堿； STAT3； Survivin

骨肉瘤(osteosarcoma)是骨科最常見的惡性腫瘤，多見于青少年，高發年齡段為15～19歲。流行病學調查和臨床研究顯示，骨肉瘤全球發病率約為4/10萬人，其惡性程度普遍較高，轉移發生時間較早，且以肺轉移最為常見[1～4]。臨床和基礎研究證實，STAT3在肺癌、前列腺癌、胃癌和骨肉瘤等多種惡性腫瘤的增殖、分化、轉移、腫瘤性血管生成以及細胞凋亡過程中扮演著重要角色，并發現下調STAT3的磷酸化可有效抑制骨肉瘤和肺癌等腫瘤細胞的體外生長[5～7]。苦參堿(Matrine, MAT)是植物苦參最主要的活性成分，研究表明，苦參堿具有抑制炎癥反應、抑制腫瘤增殖分化、腫瘤血管生成和促進腫瘤細胞凋亡等多種藥理作用，同時發現苦參堿抗腫瘤活性與抑制STAT3磷酸化密切相關[8，9]。本研究旨在探討苦參堿對成人骨肉瘤Saos-2細胞增殖的調節作用及其與STAT3活化水平的聯系。

1材料和方法

1.1主要試劑成人骨肉瘤Saos-2細胞株由上海細胞庫提供。總RNA抽提試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒和qPCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；鼠抗人survivin抗體、鼠抗人STAT3抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；苦參堿(美國Sigma公司)，DMEM培養基(美國Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青)，MTT試劑盒(美國Promega公司)。其余試劑均為分析純。

1.2細胞培養Saos-2細胞常規接種在含10% FBS、100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37℃、5% CO2孵箱內培養，每48小時換液、傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3細胞活性分析(MTT比色試驗)取對數生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96 孔培養板中，每孔接種100μl約含5×103個細胞。貼壁后無血清培養細胞16～24 h，使細胞同步化。空白對照組加入PBS，低劑量苦參堿干預組(MAT-L組)加入苦參堿(終濃度為0.25 mg/ml)，高劑量苦參堿干預組(MAT-H組)加入苦參堿(終濃度為2.5 mg/ml)，在37 ℃、5% CO2條件下培養細胞。使用MTT比色試驗對不同時間點(0、24和48 h)的細胞生長狀態進行測定，重復實驗4次。細胞活性(%) = (OD干預組/OD 對照組)×100%[10]。

1.4qPCR法檢測survivin mRNA表達水平按照試劑盒說明書提取細胞的總RNA并合成cDNA。然后進行熒光定量PCR擴增，反應體系為25 μl，使用β-actin作為內參照。引物序列如下：survivin正義：5′-CATGG GTGCCCCGA CGTTG-3′，反義：5′-GCTCCG GCCAGAG GCCTCAA-3′；β-actin正義：5′-CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT -3′，反義：5′-ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA-3′。使用2-ΔΔCt法對survivin mRNA表達水平進行測定，ΔΔCt=(Ct,目標-Ct, β-actin)干預組-(Ct,目標-Ct, β-actin)對照組。

1.5Western blot法檢測survivin蛋白表達水平和STAT3活化水平按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1小時，分別加入鼠抗人單克隆抗體survivin (1∶900)、phospho-STAT3 (1∶1000)、STAT3 (1∶1000)和β-actin (1∶1500)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

2結果

2.1MTT法測定結果與對照組比較，苦參堿干預后不同時間點(0、24和48h)Saos-2細胞活性呈時間依賴性和劑量依賴性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　MTT比色法測定Saos-2細胞活性

注：與Control組比較，①P<0.05；與MAT-L組比較，②P<0.05

2.2survivin表達水平與對照組相比較，苦參堿干預24小時后，Saos-2細胞survivin的表達水平呈劑量依賴性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表2。

2.3STAT3活化水平與對照組相比，苦參堿干預24小時后，Saos-2細胞STAT3活化水平呈劑量依賴性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖2。

圖1Saos-2細胞survivin蛋白表達的western blot結果

Figure 1The western blot result of the protein expression of survivin in Saos-2 cells

Table 2The expression of survivin and the activation of STAT3 in Saos-2 cells

組別survivinmRNAsurvivin蛋白STAT3活化水平Control組10.94±0.050.96±0.02MAT-L組0.75±0.13①0.77±0.12①0.75±0.11①MAT-H組0.38±0.04①②0.45±0.08①②0.41±0.06①②

注：與Control組比較，①P<0.05；與MAT-L組比較，②P<0.05

3討論

骨肉瘤是源于成骨細胞(osteoblast)、成軟骨細胞(chondroblast)和成纖維細胞(fibroblast)等骨組織細胞的惡性腫瘤[1～4]。骨肉瘤多見于青少年， 15～19歲

圖2Saos-2細胞STAT3活化的western blot結果

Figure 2The western blot result of the activation of STAT3 in Saos-2 cells

為高發年齡段，約60%的患者<20歲，>60歲的患者僅占10%左右[1～4]。流行病學調查和臨床研究顯示，骨肉瘤發病率位居青少年惡性腫瘤發病率的第三位，全球發病率約為4/10萬人[1～4]。同時研究顯示，骨肉瘤的惡性程度一般較高，易出現原位復發，且部分患者早期即出現血運轉移，以肺和肝臟轉移最為常見[1～4]。目前骨肉瘤的治療仍以放化療為主，患者中位生存期和1年生存率等指標仍不理想。發掘新的有效治療骨肉瘤的藥物具有較高的臨床意義。

苦參又稱地槐、野槐，是豆科槐屬植物苦參的干燥根莖部分，臨床多用于細菌性皮炎、細菌性痢疾及婦科炎癥的治療。苦參堿(Matrine, MAT)是中藥苦參最主要的有效成分，研究發現，苦參堿具有抑制氧化應激、抑制炎癥反應、抑制腫瘤增殖分化、腫瘤血管生成和促進腫瘤細胞凋亡等多種藥理作用[11～14]。包桂蘭等研究發現，苦參堿可以通過抑制氧化應激反應和炎癥反應減輕局灶性腦缺血大鼠神經元的損傷[11]。Ma X等研究發現，苦參堿能有效地減輕博萊霉素誘導的小鼠肺組織炎癥反應和纖維化[12]。趙軍艷等發現，苦參堿可以通過促進腫瘤凋亡抑制肝癌SMMC-7721的分化和增殖[13]。馬玲娣等人還發現，苦參堿對白血病K562細胞有顯著地抑制作用[14]。在本研究中我們發現苦參堿干預后，骨肉瘤Saos-2細胞活性呈時間依賴性和劑量依賴性降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。提示苦參堿對骨肉瘤Saos-2細胞的增殖有顯著抑制作用。

進一步研究發現，苦參堿的抗腫瘤和抗炎等生物活性與STAT3密切相關。STAT3屬于轉錄信號傳導子與激活子家族(signal transducers and activators of transcription, STATs)成員，廣泛參與了炎癥反應、細胞增殖和分化、血管生成和凋亡調控等多種病理和生理過程。王秀玉等人發現，苦參堿可以通過JAK2/STAT3信號通路有效減輕感染性休克大鼠腎組織的炎癥反應和組織損傷[15]。同時研究還發現，STAT3對肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌和骨肉瘤等多種惡性腫瘤的增殖、分化、轉移、腫瘤性血管生成以及細胞凋亡過程亦有重要的調控作用[5～7,16，17]。下調STAT3的活化和表達可以有效抑制多種腫瘤細胞的增殖和分化，并認為該過程與促進腫瘤細胞凋亡密切相關[5～7,18]。孫紹娟等人證實，使用siRNA技術沉默STAT3可以有效抑制肺腺癌A549細胞的增殖和分化。Tu B等人通過在體和離體實驗研究證實，IL-6可以通過上調STAT3活化促進骨肉瘤Saos-2細胞的增殖和轉移，同時發現抑制STAT3后Saos-2細胞增殖和轉移能力顯著降低[16]。Wang X等人的研究也發現，STAT3抑制劑S3I-201對包括Saos-2細胞等多個骨肉瘤細胞系有顯著地抑制作用，并可促進骨肉瘤細胞凋亡[17]。在本研究中我們對STAT3的活化水平及STAT3下游細胞增殖和凋亡調控關鍵分子survivin進行了分析，發現在給予苦參堿干預24小時后Saos-2細胞的STAT3活化水平及survivin mRNA和蛋白表達水平呈劑量依賴性下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示苦參堿對骨肉瘤Saos-2細胞STAT3的活化有顯著抑制作用。

4結論

本實驗結果表明，苦參堿可以通過抑制STAT3磷酸化下調survivin的表達，從而抑制骨肉瘤Saos-2細胞的增殖。本實驗為苦參堿應用于骨肉瘤及其他惡性腫瘤的臨床治療提供了新的思路。

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Matrine suppresses the proliferation of osteosarcoma Saos-2 cells by inactivation of STAT3YAN Xiaoming, LIAN Fuming, LIN Zhiqin,etal

(1.DepartmentofOsteology,TheAffiliatedSanmingFirstHospitalofFujianMedicalUniversity,

Sanming365000,Fujian,China;

2.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610500,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the anti-proliferative value of matrine (MAT) in osteosarcoma Saos-2 cells, and its underlying mechanism. MethodsOsteosarcoma Saos-2 cells were divided into 3 groups, Control group, Low-dosage matrine (MAT-L) group and High-dosage matrine (MAT-H) group. MTT was performed to measure the cell viabilities of Saos-2 cells in different time points (0h, 24h and 48h). After 24 hours interventions, the mRNA expression of survivin was analyzed by qPCR. Meanwhile, the protein expression of survivin and the activation of STAT3 were detected by western blot.ResultsThe cell viabilities of Saos-2 cells were time-dependently and dosage-dependently inhibited by MAT administrations. Meanwhile, after 24 hours intervention, the mRNA and protein expression of survivin, and the activation of STAT3 were all dosage-dependently down-regulated by MAT in Saos-2 cells. ConclusionMatrine (MAT) could inhibit the tumor proliferation and survivin expression through inactivation of STAT3 in osteosarcoma Saos-2 cells.

【Key words】Saos-2 cells; Matrine; STAT3; Survivin

(收稿日期：2015-01-13； 編輯： 母存培)

基金項目：四川省教育廳課題(11ZB172)

【中圖分類號】R-33

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.09.002