二甲基亞砜對泡狀棘球蚴原頭節(jié)的影響

摘要：目的 探討溶媒二甲基亞砜對體外培養(yǎng)泡狀棘球蚴原頭節(jié)的毒性作用，為藥物實(shí)驗(yàn)篩選合適的助溶劑濃度。方法 觀察不同濃度的DMSO干預(yù)下的泡狀棘球蚴原頭節(jié)的存活生長情況，記錄原頭節(jié)的存活率。結(jié)果 DMSO低濃度組（0.10、0.50、1.00 g/ml）幾乎無細(xì)胞毒性。DMSO濃度≥2.00g/ml時(shí)，隨濃度和作用時(shí)間的加長，泡球蚴原頭節(jié)存活率下降。2.00g/ml組作用8d時(shí)；4.00g/ml組作用6d、8d時(shí)；8.00g/ml組作用4d、6d時(shí)，與空白組有顯著差異（P<0.05）。作用8d時(shí)，8.00g/ml組原頭節(jié)全部死亡。結(jié)論 對泡狀棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行體外藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，濃度小于等于1.0g/ml的DMSO可用作助溶劑，該濃度泡球蚴原頭節(jié)毒性作用小。

關(guān)鍵詞：泡狀棘球蚴；二甲基亞砜；原頭節(jié)

泡型棘球蚴?。╝lveolar echinococcosis，AE）是由多房棘球絳蟲（Echinococcosis multaloculuras，Em）幼蟲寄生于人體所致的一種致死性的寄生蟲病。泡型棘球蚴病可發(fā)病于機(jī)體多個(gè)部位，以肝臟發(fā)病最多見。目前，肝泡型包蟲病的手術(shù)治療相對肝囊型包蟲?。‥chinococcosis granulosa，EG）要困難，且并非所有患者初診時(shí)都能施行根治性手術(shù)，有些患者不能耐受手術(shù)或已經(jīng)失去手術(shù)時(shí)機(jī)，對于這些患者，藥物治療則成為最佳治療手段。但是目前包蟲病的藥物治療效果仍不理想[1]，部分患者無法耐受且可引起不良反應(yīng)[2，3]，因此，有效的、副作用小的抗包蟲藥物制劑是包蟲病防治研究的重要課題之一。

抗包蟲新藥的研發(fā)過程中，首先要進(jìn)行藥物的體外實(shí)驗(yàn)，部分藥物樣品水溶性較差，需要加入有機(jī)溶劑或表面活性劑對其進(jìn)行溶解，而有機(jī)溶劑或表面活性劑本身都有不同程度的細(xì)胞毒性或能夠影響細(xì)胞生長，不同的溶劑間和不同細(xì)胞間存在著差異。二甲基亞砜（DMSO）是常用的助溶有機(jī)化合物，DMSO對許多藥物具有溶解性、滲透性，能增加藥物吸收和提高療效，常作為細(xì)胞冷凍保護(hù)劑用于骨髓、臍血的超低溫長期保存[4]。本研究旨在考察常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下，泡狀棘球蚴原頭節(jié)對DMSO的耐受范圍和最大耐受濃度，為其在藥物干預(yù)中應(yīng)用提供濃度參考。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器 感染泡球蚴倉鼠（腹腔保種16W）購于新疆自治區(qū)疾病控制中心；二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)；倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)，中國博訊公司生產(chǎn)。

1.1.2主要試劑 DMEM（High Glucose）培養(yǎng)液購于Thermo Fisher公司；胎牛血清購于碧云天公司；青霉素、鏈霉素購于南京生興生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1泡狀棘球蚴原頭節(jié)的收集 安樂死種鼠，在無菌條件下取出種鼠腹腔內(nèi)泡型棘球蚴組織，無菌PBS液漂洗三次，剪碎、研磨、過80目鋼篩，無菌PBS液沖洗，1000μl移液器充分吹打后靜置，可看見分三層：最下層為較少量瓷白色的頭節(jié)，中間層為包囊破碎組織、生發(fā)層細(xì)胞等（最多），最上層為宿主破碎組織（肝組織、血液等）。移液器移除最上層和部分中間層懸濁液后，添加適量PBS，吹打數(shù)次后靜置。重復(fù)三次后，棄上清液，1000μl充分吹打液體，迅速用10μl移液器抽取10μl懸濁液滴于載玻片上，滴加0.5%伊紅染液，蓋蓋玻片，鏡下觀察，結(jié)構(gòu)清晰，若染色率≤10%，可用于體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 稱量DMSO，以完全培養(yǎng)基稀釋至所需實(shí)驗(yàn)濃度，混勻后微孔濾過膜過濾除菌。按DMSO不同濃度，實(shí)驗(yàn)分組為0、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00g/100ml。收集原頭節(jié)，按實(shí)驗(yàn)分組與含不同濃度DMSO培養(yǎng)基混勻后置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組中約5000枚泡狀棘球蚴原頭節(jié)。

1.2.3泡狀棘球蚴原頭節(jié)活性的計(jì)算 每組等量取20μl原頭節(jié)培養(yǎng)液伊紅染色，在倒置顯微鏡下觀察判斷標(biāo)準(zhǔn)：活力減弱或死亡的原頭節(jié)染紅色，無活動(dòng)性，可伴結(jié)構(gòu)破壞；活頭節(jié)不著色且有活動(dòng)性。計(jì)數(shù)每100個(gè)原頭節(jié)中著色數(shù)目，以有活力頭節(jié)占所觀察原頭節(jié)的比例計(jì)算存活率，每組每時(shí)間點(diǎn)共300個(gè)原頭節(jié)計(jì)算存活率。至最高濃度DMSO組原頭節(jié)無活性頭節(jié)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用（x±s）表示。按α=0.05為水準(zhǔn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

各組泡球蚴原頭節(jié)的存活率 DMSO低濃度組（0.10、0.50、1.00g/ml）與空白組頭節(jié)存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），DMSO濃度≥2.00g/ml時(shí)，隨濃度和作用時(shí)間的加長，泡球蚴原頭節(jié)存活率下降。2.00g/ml組作用8d時(shí)，存活率與空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；4.00g/ml組作用6d、8d時(shí)，存活率與空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）； 8.00g/ml組作用4d、6d時(shí)，與空白組有顯著差異（P<0.05），作用8d時(shí)，泡球蚴原頭節(jié)全部死亡。綜合頭節(jié)存活情況，DMSO≤1.00g/ml對原頭節(jié)無明顯毒性作用，可用作短時(shí)間的體外藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)，見表1。

3 討論

肝棘球蚴?。╤epatic echinococcosis）又稱肝包蟲?。╤epatic hydatidosis），是流行與世界畜牧業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)常見的人畜共患性寄生蟲病。我國目前證實(shí)致病者為：①細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcosis granulosus，E.g）；②多房棘球絳蟲（E.multilocularis，E.m）。肝泡狀棘球蚴病的最佳治療方法為手術(shù)。不同于細(xì)粒棘球絳蟲感染，泡狀棘球蚴病的病變組織與鄰近的正常組織之間并沒有明顯可分離間隙，且該病前期無明顯癥狀及體征，多數(shù)患者就診時(shí)已錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，故此病手術(shù)根治率底。目前臨床上多以單一苯并咪唑類藥物治療，部分患者無法耐受且可引起不良反應(yīng)。目前對于該病的新藥物和劑型的研發(fā)在進(jìn)行中。

許多抗包蟲藥物如阿苯達(dá)唑水溶性很差，在進(jìn)行體外藥物包蟲試驗(yàn)時(shí)不能有效地檢測到這些藥物的藥效，為顯示真正的抗包蟲效果，通常加入有機(jī)溶劑促藥物溶解。但是許多此類溶劑本身都有不同程度的臨床毒性[5]，同樣在體外試驗(yàn)中，也顯示特異的細(xì)胞毒性或?qū)?xì)胞的生長產(chǎn)生影響[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，助溶劑對原頭節(jié)的細(xì)胞毒性隨濃度的增大而増強(qiáng)；低濃度的DMSO（0.10、0.50、1.00g/100ml）幾乎無細(xì)胞毒性（P<0.05），而較高濃度的DMSO對原頭蚴均表現(xiàn)出一定毒性作用，其毒性效應(yīng)具有濃度依賴的特征。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DMSO在濃度≤1.00g/100ml時(shí)，對泡球蚴原頭節(jié)無明顯毒性，可以作為泡球蚴原頭節(jié)體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)中的助溶劑。在進(jìn)行藥物篩選時(shí)，應(yīng)測定DMSO對藥物的助溶作用，選擇合適的濃度。在對于抗包蟲藥物的研究中，助溶劑的毒性以及藥物的溶解性仍需加以關(guān)注。

參考文獻(xiàn)：

[1]張學(xué)農(nóng)，陳靖，張強(qiáng).阿苯達(dá)唑納米球體外釋放和大鼠體內(nèi)吸收動(dòng)力學(xué)的相關(guān)性研究[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38（12）：932-935.

[2]Molavipour A， Javan H， Moghaddam AA， et al. Combined medi-cal and surgical treatment of intracardiac hydatid cysts in 11 patients[J]. J Card Surg， 2010， 25（2）；143-146.

[3]Hemphill A， Spicher M， Stadelmann B， et al. Innovative chemotherapeutical treatment options for alveolar and cystic echinococcosis[J]. Parasitology， 2007，134；1657-70

[4]陳秀仁，張懷有，田錫義，等.二甲基亞砜的性質(zhì)和應(yīng)用[J].遼寧化工，2000，29（1）：31-35.

[5]Brobyn RD. The Human toxicology of dimethy l sulfoxide[J].Ann NY Acad Sci，1975，243：497-506.

[6]楊遠(yuǎn)和.二甲基亞砜對人表皮的核酸和蛋白質(zhì)合成的影響[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志， 1994，12（1）：32-34.

編輯/成森