結(jié)核感染T細胞檢測在結(jié)核病診斷中的應用價值

摘要：目的 探討結(jié)核感染T細胞檢測，體外釋放酶聯(lián)免疫法Diagnostic Kit for T cell infected with Mycobacterium tuberculosis在結(jié)核病診斷中的應用價值。方法 選取我院2014年7月～2015年1月78例患者作為研究對象，采用體外釋放酶聯(lián)免疫法原理衡量特異性抗原介導的細胞免疫反應強度。通過結(jié)核分枝桿菌特異性重組抗原刺激結(jié)核分枝桿菌感染者特異性T淋巴細胞并使其增殖，釋放IFN-γ。微孔條上預包被德IFN-γ抗體可與樣品中的IFN-γ結(jié)合，再加入酶標試劑進行二次溫育。當樣品中存在IFN-γ時，將形成\"包被抗體-IFN-γ-酶標抗體\"復合物、復合物上連接的HRP催化顯色劑反應，生成藍色產(chǎn)物，終止反應成變成黃色。若樣品中無INF-γ時，不顯色。通過酶標儀檢測吸光度（A值），用校準品濃度值與A值擬合乘冪曲線，計算樣品中IFN-γ含量，從而判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)果 本組78例患者中有36例患者的IFN-γ為陽性，占總數(shù)的46.2%。因為，一個合理正規(guī)的治療方案必然有明確的診斷、合理科學的用藥劑量、足夠的療程，還要規(guī)律、早期用藥，才能治愈結(jié)核病。其中早期明確診斷則是關(guān)鍵。結(jié)論 要想徹底治療結(jié)核必須遵循以上五個原則、早期、聯(lián)合、適量、規(guī)律、全程、才能確保查出必治、治必徹底。因此，提高結(jié)核病的早期診斷顯得更為重要。

關(guān)鍵詞：結(jié)核病早期診斷；結(jié)核感染T細胞；體外釋放酶聯(lián)免疫法

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種傳染性疾病，結(jié)核分枝桿菌屬于放線菌目分枝桿菌屬，主要通過空氣傳播，可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為多見，結(jié)核病患常見發(fā)熱、盜汗、疲倦乏力、精神萎靡、體重減輕、食欲不振以及咳嗽、咳痰咯血等臨床癥狀。結(jié)核感染T細胞檢測培養(yǎng)管含致病性結(jié)核分枝桿菌特有而卡介苗，其他分枝桿菌沒有的缺失區(qū)域1（RD1）中兩種基因的重組抗原，經(jīng)體外全血培養(yǎng)，刺激全血標本中結(jié)核抗原特異性T細胞產(chǎn)生免疫應答。用于定量檢測人全血標本經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原體外刺激后產(chǎn)生的γ-干擾素（IFN-γ）的濃度，從而判斷其是否具有針對結(jié)核分枝桿菌特異性的T細胞免疫反應，即結(jié)核感染T細胞檢測。該方法可用于結(jié)核感染（潛伏感染或活動感染）的輔助診斷，其結(jié)果雖不能代替痰涂片、培養(yǎng)或影像學等其他較為經(jīng)典的結(jié)核分枝桿菌感染的診斷方法，但可明顯提高結(jié)核病的早期診斷。

1資料與方法

1.1一般資料 為了進一步分析結(jié)核感染T細胞檢測，體外釋放酶聯(lián)免疫法在結(jié)核病中篩查的應用價值。選取我院2014年7月～2013年1月疑是結(jié)核病患者為試驗對象。其中年齡為25～62歲，平均年齡在（42.56±3.11）歲。

1.2樣本要求 使用無內(nèi)毒素的肝素抗凝真空采血管采集的新鮮全血。采集的全血標本需在2 h內(nèi)按\"N\"、\"T\"、\"P\"的順序加入到三種培養(yǎng)管中并置37℃溫箱培養(yǎng)。全血標本不可冰浴，冰凍，以防止細胞死亡。培養(yǎng)后經(jīng)過離心分離得到的血漿可在2℃～8℃存放2 d，長期存儲應低溫凍存，凍融次數(shù)應不高于2次。

1.3 IFN-γ的體外釋放 采用靜脈穿刺術(shù)，使用肝素抗凝的真空采血管采集體積不低于4 ml的全血標本。在2 h之內(nèi)將全血標本輕柔顛倒混勻3～5次后公裝到\"N\"、\"T\"、\"P\"三種培養(yǎng)管中，1 ml/管。將培養(yǎng)管輕柔顛倒混勻5次迅速放入37℃培養(yǎng)22 h左右，培養(yǎng)過程中保持培養(yǎng)管直立。培養(yǎng)后在培養(yǎng)管以3000～5000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，取血漿進行ELISA檢測。

1.4 IFN-γ的定量檢測 將不濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋。國根據(jù)瓶簽標識的體積加入注射用水，待2～3 min校準品充分溶解后，得到400 pg/ml的校準品。然后用校準品稀釋液對上述校準品進行稀釋。將樣品對應微孔按序編號，每個受試者的3種培養(yǎng)血漿各1孔，校準品各雙孔，空白對照1孔。分別在相應孔中加入樣品稀釋液20 ul，待測樣品或校準品各50 ul，置37℃溫育60 min，每孔加入酶標試劑50 ul。用封板膜封板后，置37℃溫育60 min小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干。每孔加入顯色劑A，B液各50 ul混勻，37℃避光顯色15 min每孔加入終止液50 ul混勻，10 min內(nèi)用酶標儀波長于450 nm處，用空白孔調(diào)零點后測定各孔A值。

2結(jié)果

2.1測用封板膜封板后，置37℃溫育60 min試培養(yǎng)管（T），含量值=T.本底對照培養(yǎng)管（N），含量值=N.陽性對照培養(yǎng)管釋（P），含量值=P（單位：pg/ml）。本方法最低檢出量為2 pg/ml，檢測范圍為2～400 pg/ml若待測標本的IFN-γ濃度高于400 pg/ml時，需用校準品稀釋液稀釋后重新檢測，見表1。

2.2本院78例送檢患者中，有36例患者結(jié)核感染T細胞檢測結(jié)果顯示陽性，占總數(shù)的46.2%，陽性率差不多達到50%。

3討論

結(jié)核病是嚴重危害人類健康的慢性傳染病。自上世紀80年代后期以來，受流動人口增加，流行和耐藥性結(jié)核病的增多等因素的影響，結(jié)核病在全球重新蔓延，已成為全球重大公共衛(wèi)生問題和社會問題。結(jié)核感染T細胞檢測，體外釋放酶聯(lián)免疫法可明顯提高結(jié)核病的早期診斷。要想徹底治療結(jié)核必須遵循以上五個原則、早期、聯(lián)合、適量、規(guī)律、全程、才能確保查出必治、治必徹底。因此，提高結(jié)核病的早期診斷顯得更為重要。

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