同型半胱氨酸對單核泡沫細(xì)胞ERO1α表達(dá)的影響

摘要：目的 探討不同濃度Hcy對單核泡沫細(xì)胞ERO1α mRNA和蛋白表達(dá)的影響。方法 培養(yǎng)單核源性泡沫細(xì)胞并給予不同濃度Hcy及葉酸和維生素B12干預(yù)后，分別運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測ERO1α mRNA和蛋白表達(dá)改變。結(jié)果 成功培養(yǎng)單核源性泡沫細(xì)胞并檢測ERO1α mRNA水平變化發(fā)現(xiàn)隨著Hcy濃度升高，泡沫細(xì)胞ERO1α mRNA水平呈上升趨勢，且與Hcy濃度呈劑量依賴關(guān)系；同時(shí)給予葉酸和維生素B12后可明顯降低ERO1α mRNA水平。泡沫細(xì)胞ERO1α蛋白表達(dá)改變與mRNA變化趨勢一致。結(jié)論 ERO1α在Hcy促進(jìn)單核泡沫細(xì)胞形成過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸；單核泡沫細(xì)胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1α

同型半胱氨酸（Hcy）是動(dòng)脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，但其具體致病機(jī)制尚不清楚[1]。THP-1單核泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要細(xì)胞類型，被認(rèn)為是動(dòng)脈斑塊形成的重要標(biāo)志[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1α（ER oxidoreduclin-1， ERO1α）是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種黃素蛋白，其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蛋白合成、折疊起關(guān)鍵調(diào)控作用且與細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）生產(chǎn)密切相關(guān)[3]。研究表明Hcy可以影響細(xì)胞內(nèi)過氧化及氧自由基含量等多種途徑促進(jìn)動(dòng)脈斑塊形成[4]。因此，本文主要探討不同濃度Hcy對單核泡沫細(xì)胞ERO1α表達(dá)的影響及葉酸和維生素B12對ERO1α的干預(yù)作用，為進(jìn)一步明確Hcy導(dǎo)致AS的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1 材料 THP-1單核細(xì)胞株（寧夏醫(yī)科大學(xué)心腦血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）；5415D型微量臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf，德國）；熒光定量PCR儀（上海楓嶺生物技術(shù)有限公司，中國）；垂直電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；HyClone RPMI-1640培養(yǎng)基（Thermo）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；Hcy（Sigma）；RNA提取試劑盒（北京天根生物技術(shù)有限公司）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒（美國Invitrogen公司）；蛋白提取試劑盒 （南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；ERO1α兔抗人一抗（Abcam公司），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 THP-1單核泡沫細(xì)胞培養(yǎng)與分組 在THP-1單核細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，傳代培養(yǎng)，以4×106/ml個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入PMA使其終濃度為100 nmol·L-1，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)，形狀不規(guī)則并有偽足伸出，證實(shí)THP-1單核細(xì)胞已分化為巨噬細(xì)胞。棄去舊培養(yǎng)液，更換為含終濃度50 mg·L-1 ox-LDL的不同濃度Hcy的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察泡沫細(xì)胞形成并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分組以0 mol·L-1 Hcy泡沫細(xì)胞為對照組，不同濃度Hcy（50、100、200、500 mol·L-1）和500 mol·L-1 Hcy+葉酸+維生素B12（500+F+V）干預(yù)泡沫細(xì)胞，每組3瓶。

1.3 泡沫細(xì)胞油紅O染色 將干預(yù)后的泡沫細(xì)胞用PBS緩沖液洗3次，10%多聚甲醛固定10 min，60%乙醇浸泡1 min，油紅O染色10 min，60%異丙醇分色3 min，雙蒸水洗5 min，蘇木素染色1 min，雙蒸水洗待干后用水性封固劑封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測ERO1α的mRNA水平 按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)人ERO1α引物，引物序列為上游：5'-ATCCTTTGGCTTCTGGTCAAG-3'，下游：5'-GTTGTGTCCCCATTTCTTTTC T-3'；以人GAPDH為內(nèi)參；上游：5'-GGTGAAGGTCG

GTGTGAACG-3'，下游：5'-CTCGC TCCTGGAAGATGGTG-3'；PCR條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延長30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)合擴(kuò)增曲線及溶解曲線，選擇符合要求的qRT-PCR原始數(shù)據(jù)，結(jié)果用2-△△CT法分析。

1.5 Western blot檢測ERO1α的蛋白表達(dá)改變 細(xì)胞裂解法提取各組細(xì)胞蛋白，取總蛋白20μL，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，80V 30min，120V 60min，15V恒壓轉(zhuǎn)膜10min，與ERO1α特異性一抗37 ℃溫育2h，4 ℃過夜；與二抗（含HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG）室溫孵育1.5 h后，加入顯色底物。以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像分析儀上成像分析，計(jì)算ERO1α與β-actin灰度值的比值，進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（ x±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1泡沫細(xì)胞鑒定 油紅O染色后光鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有大量的紅色脂質(zhì)顆粒存在，且個(gè)別細(xì)胞由于吞噬的脂滴過多而使體積增大，符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。

2.1 不同濃度Hcy干預(yù)泡沫細(xì)胞后ERO1 mRNA表達(dá)變化 使用0、50、100、200、500 μmol·L-1不同濃度Hcy干預(yù)泡沫細(xì)胞后，檢測ERO1α mRNA水平變化發(fā)現(xiàn)，Hcy可以增加泡沫細(xì)胞ERO1α mRNA表達(dá)水平，且隨著Hcy濃度增加，ERO1α表達(dá)增多（P<0.05），呈劑量依賴關(guān)系。給予500μmol·L-1Hcy加葉酸和維生素B12干預(yù)后，ERO1α表達(dá)降低（P<0.05）。

2.2 不同濃度Hcy干預(yù)泡沫細(xì)胞后ERO1蛋白表達(dá)變化 使用不同濃度Hcy干預(yù)泡沫細(xì)胞后，檢測ERO1α 蛋白水平變化發(fā)現(xiàn)，與0 μmol·L-1組比較，Hcy可以增加泡沫細(xì)胞ERO1α蛋白表達(dá)，且隨著Hcy濃度增加，ERO1α表達(dá)增加（P<0.01），呈劑量依賴關(guān)系。同時(shí)，給予葉酸和維生素B12干預(yù)后，ERO1α蛋白表達(dá)水平降低。

3討論

大量的臨床和流行病學(xué)證據(jù)表明同型半胱氨酸（Hcy）是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。Hcy致動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)制包括氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，NO的生物活性降低導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)脂蛋白氧化和血小板活化，泡沫細(xì)胞在內(nèi)皮下聚集，增強(qiáng)凝血作用，以及增加肝細(xì)胞膽固醇的合成等[5]。Hcy 作為蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物，含有活潑的自由巰基（-SH），極易發(fā)生自身氧化，生成超氧化物、過氧化氫和羥基自由基等多種強(qiáng)氧化物，導(dǎo)致機(jī)體氧化還原態(tài)失衡，啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而損傷細(xì)胞，加速細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白（LDL）氧化成為ox-LDL，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL 形成泡沫細(xì)胞[6]。然而，Hcy如何促進(jìn)體內(nèi)過氧化物質(zhì)產(chǎn)生及堆積的分子機(jī)制仍不清楚。我們的研究結(jié)果為這一問題給出了可能的解釋：Hcy可以促進(jìn)單核泡沫細(xì)胞ERO1α表達(dá)增加，且與Hcy濃度改變呈劑量依賴關(guān)系。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶l （ERO1α）是ER腔內(nèi)氧化當(dāng)量的重要來源，主要維持ER內(nèi)氧化狀態(tài)。同時(shí)EROlα激活也是細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的重要來源。尤其在大量分泌蛋白質(zhì)時(shí)，經(jīng)粗略估算超過25%的ROS是在蛋白質(zhì)分泌時(shí)產(chǎn)生的，當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過抗氧化防御能力的時(shí)候，過多的ROS會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激等損傷反應(yīng)[7]。因此，ERO1α可能在Hcy促進(jìn)單核泡沫細(xì)胞形成，體內(nèi)氧化物質(zhì)堆積中發(fā)揮重要作用，這位我們進(jìn)一步研究Hcy的致病機(jī)制提供的重要線索。

葉酸和維生素B12作為Hcy代謝的輔助因子在體內(nèi)發(fā)揮重要作用。葉酸和維生素B12缺乏可明顯升高Hcy水平。已經(jīng)證實(shí)葉酸治療在降低血漿Hcy水平的同時(shí)，還具有獨(dú)立的抗氧化作用，而且能夠增加NO合酶的活性，這些都能抑制早期動(dòng)脈粥樣硬化的形成[8]。在Hcy促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成過程中，同時(shí)給予葉酸和維生素B12后可以降低ERO1α表達(dá)，這進(jìn)一步說明了ERO1α在Hcy引起的氧化損傷中發(fā)揮重要作用。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們分析了ERO1α在Hcy誘導(dǎo)的單核泡沫細(xì)胞形成中發(fā)揮重要作用，且其可能是調(diào)控細(xì)胞過氧化的重要調(diào)控基因，這為我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Hcy致動(dòng)脈粥樣硬化硬化提供了新的線索和干預(yù)靶點(diǎn)。

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編輯/馮焱