HPLC—DAD測定潤腸丸（濃縮丸）中大黃酸成分

摘要：目的 建立潤腸丸中大黃酸成分的高效液相色譜測定方法。方法：Phenomenex Luna C18柱（5um，150x4.60mm，100A）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（60：40）；流速：1.0mL·min-1；二極管陣列檢測器，檢測波長：254nm；柱溫：40℃。結果：該方法測定潤腸丸中大黃酸成分時，線性關系良好，r2=1.000，平均回收率（n=6）為99.35%。結論：方法簡便，快速準確，可作為樣品的檢測方法。

關鍵詞：潤腸丸（濃縮丸）；大黃酸；高效液相色譜法

Determination of the Rhein in Runchang Pills （Concentrated pill） by HPLC-DAD

ZHU Ren-yuan1，PU Yu-hong2

（1.Lanzhou Institute for Food and Drug Control，Lanzhou 730000，Gansu，China；2.Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730000，Gansu，China）

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the determination of the contents of rhein in Runchang pills.Methods The separation was performed on Phenomenex Luna C18 column（5um，150x4.60mm，100A）with a mobile phase of acetonitrile-1% Phosphoric acid（60：40），and the flow rate were 1.0mL·min-1.Photodiode Array detector was used and the wavelength of detector for rhein was set at 254nm，and 40℃ for column.Results The method for determining runchang pill in rhein composition， linear relationship is good， r2 = 1.000， and the average recovery （n = 6） was 99.35%.Conclusion The method is accurate and sensitive.

Key words：Punchang pills （Concentrated pill）；Rhein；HPLC

當今，中成藥在歐美發達國家愈加普及，特別是一些合成藥品頻現嚴重不良反應，使得公眾愈加傾向于接受中成藥，傳統醫藥產業發展迅速且前景看好。與此同時，傳統藥品由于缺乏管理而產生的安全隱患也越來越引起政府有關部門和立法機關的重視，歐盟各國政府和立法部門開始加強對此類產品的管理和立法，對產品質量和安全性的要求將越來越高，中成藥在歐洲以食品或食品補充劑銷售的前景將面臨越來越多的限制。中成藥需要找到符合其本身特點和規律的立足點，即中成藥既要以治療藥物的身份進入歐洲市場，同時也要繼續尋求擴大作為食品補充劑的渠道。潤腸丸（濃縮丸）是我國衛生部藥品標準中藥成方制劑，由大黃、當歸、桃仁、羌活及火麻仁5味中藥制成濃縮丸，主要有潤滑腸壁、軟化干結大便、增強腸管蠕動、抗菌、解熱等作用，用于治療實熱便秘。其中大黃具有導滯通便、瀉火解毒等作用。其化學成分主要含蒽醌衍生物，如大黃酸、大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚，大部分為結合狀態。為了比較全面地控制潤腸丸的質量，我們以該制劑中大黃含有的大黃酸作為指標成分，用HPLC法建立其含量測定方法。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20AB高效液相色譜儀系列：在線脫氣機，二元泵，二極管陣列檢測器，自動進樣器，柱溫箱，色譜工作站；梅特勒XS-205電子分析天平，十萬分之一；成都康宇RE-2000旋轉蒸發儀；對照品：大黃酸對照品（0757-200206），供含量測定用，購自中國藥品生物制品檢定所；潤腸丸（濃縮丸）（批號：12D1A、2012028-2、2012092、12E2A、2012078-3、2012098-4，規格：每8丸相當于原生藥3g），由蘭州佛慈制藥股份有限公司生產；超純水制備儀，成都超純科技有限公司，型號UPH-I-10T；甲醇、磷酸均為色譜純，其他試劑為分析純。

2溶液的制備

2.1 對照品溶液 精密稱取大黃酸對照品10.68mg，置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液 精密稱取潤腸丸（濃縮丸）粉末2g，加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理1小時，放冷。再稱定重量，用甲醇補足減失的量，搖勻，濾過。精密量取續濾液5mL，揮去溶劑，加2.5mol·L-1鹽酸溶液10mL，超聲處理5min，再加入氯仿10mL，超聲處理1h，放冷，置分液漏斗中，分取氯仿層，酸液用氯仿萃取4次，20mL/次，合并氯仿液，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，轉移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液進行HPLC測定。

3 實驗方法

3.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（5um，150x4.60mm，100A，廣州菲羅門公司生產）；流動相：甲醇-0.1%磷酸=75：25；流速：1.0mL·min-1；進樣：10uL；檢測波長：254nm；柱溫：40℃。

圖1 大黃酸對照品與潤腸丸（濃縮丸）樣品的色譜吸收圖譜

3.2 線性關系考察 分別精密吸取大黃酸對照品溶液1mL、5 mL、10mL、15 mL和20 mL置25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按上述色譜條件，進樣10uL，測定其峰面積，以進樣量（ug）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，其回歸方程為：Y = 10190954.34X - 100859.21 ，r=0.9999。線性范圍為：0.03～1.28ug。

表1 線性關系測定數據

進樣量（ug） 0.04272 0.2136 0.4272 0.6408 0.8544

峰面積 337190 20784474203588 64315788608137

3.3 最低檢測限 在選定的色譜條件下，當信噪比S/N=3時，對大黃酸最低檢測限進行測定，結果表明，大黃酸的最低檢測限為1.068ug·mL-1。

3.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10uL，連續進樣6次，測定峰面積，計算精密度。結果大黃酸的RSD（n=6）為0.52%。

表2 精密度試驗檢測數據

序號 1 2 3 4 5 6

峰面積 4203588 4240971 4245886 4239507 4254324 4203892

3.5 穩定性試驗 精密吸取對照品溶液，分別于0h、6 h、12 h、24 h、36h與48 h時進樣，每次10uL，測定峰面積，計算精密度。結果大黃酸的RSD（n=6）為0.57%。

表3 穩定性試驗檢測數據

序號 1 2 3 4 5 6

峰面積 4186294 4235077 4233106 4222376 4207839 4177783

3.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的6份潤腸丸（濃縮丸）樣品（批號：12D1A，大黃酸含量0.98mg/g）各0.5g，按\"2.2\"項制備，分別精密加入一定量的大黃酸對照品溶液，按\"3.1\"項下色譜條件進樣10uL，測定大黃酸含量，計算回收率，結果平均回收率為（x±s，n=6）為99.35%±0.57%。

表4 加樣回收率試驗檢測數據

3.7 樣品測定 按照本文方法，對6批潤腸丸進行測定，用回歸方程法計算含量，每批平行測定2份，結果見表5。

表5 樣品含量測定結果（mg·g-1，n=2）

批號 12D1A 2012028-2 2012092 12E2A 2012078-3 2012098-4

大黃酸 0.98 0.70 1.19 0.68 0.76 1.49

大黃酸對照品的UV光譜 潤腸丸樣品的UV光譜

圖2 UV光譜對比，相似度達到0.998。

3.8 空白試驗 按照\"2.2\"項下方法制備陰性制劑，按\"3.1\"方法分析，陰性樣品色譜在大黃酸相應保留時間位置無干擾峰。

4 結果與討論

4.1 檢驗方法選擇 潤腸丸（濃縮丸）由大黃、當歸、桃仁、羌活及火麻仁等五味組成。曾設想用薄層色譜法進行檢查，但由于處方復雜，干擾成分多，未能有效分離。采用高效液相色譜法，大黃酸檢驗靈敏度高，可實現有效檢測。

4.2 色譜條件優化 對照品溶液在190-600nm范圍內進行全波長掃描，結果表明：大黃酸在255+2nm處有最大吸收，通過實驗，確定254nm為檢測波長。考察了不同比列、類型的流動相組成，確定在\"3.1\"項下的色譜條件下，大黃酸保留時間為4.561min，樣品中大黃酸的色譜峰與其他峰的分離度大于2.0。

4.3 考察了不同提取溶劑、不同超聲時間和方法的影響，實驗結果表明，在酸性條件下，超聲處理后用氯仿萃取，可獲得較高的提取效率。

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