非小細胞肺癌中腺癌EGFR基因突變情況分析

摘要：目的 觀察非小細胞肺癌（NSCLC）中腺癌患者EGFR基因突變情況及其與臨床特征的關系。方法 采用RT-PCR擴增和DNA測序技術分析肺腺癌EGFR基因第19和2l號外顯子突變情況，并分析其與臨床因素的相關性。結果 152例肺腺癌患者中有98例（64.5%）發生EGFR基因突變，其中45例（45.9%）為發生于第19號外顯子的突變，54例（54.1%）為發生于第21號外顯子的突變。入組患者中，女性突變率為58.2%高于男性（48.1%），且具有統計學意義。非吸煙者突變率為41.5%，低于長期吸煙者（57.1%）。肺腺癌EGFR基因突變患者中，Ⅰ期有50例（51.0%），Ⅱ期20例（20.4%），Ⅲ期28例（28.6%）。結論 在肺腺癌中，EGFR基因突變以Ⅰ期多見，其中以第21號外顯子的突變較為常見，與年齡、性別及吸煙無明顯相關性。

關鍵詞：非小細胞肺癌，表皮生長因子受體，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，基因突變

Mutational Analysis of EGFR in Non-small Cell Lung Cancers with Adenocarcinoma

MIAO Feng，SONG Yang，PANG Lie-wen，CHEN Zhi-ming

（Department of Cardiothoracic Surgery，Huashan Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai 200040，China）

Abstract：Objective To investigate gene mutations of the epidermal growth factor receptor（EGFR）in non-small cell lung cancers（NSCLC）with adenocarcinoma and their relationship with clinical factors.Methods Mutations of exons 19 and 21 of the EGFR in 152 NSCLC with adenocarcinomas were detected by Real-time PCR-amplifying and gene sequencing，and the relationship between mutations and clinical characters of NSCLC with adenocarcinomas were analyzed.Results We detected 98 EGFR mutations（64.5%）in 152 cases，the majority of which was in-frame exon 45（45.9%）and 54 cases was in exon 21（54.9%）.Moreover，in NSCLC patients with adenocarcinoma，mutations were significantly more frequently observed in females（58.2%）than in males（48.1%），and significantly lower in non-smokers（41.5%）than in smokers（57.1%）.In adenocarcinoma patients with mutation of EGFR，we detected 50 cases in StageⅠ（51.0%），20 cases in StageⅡ（20.4%），28 cases in StageⅢ（28.6%）.Median survival of EGFR mutations patients is 23.10±1.61 months.Conclusion Our data suggest that mutation frequency of EGFR in lung cancers patients with adenocarcinomas is Stage I，and majority of which were in exon 21.

近年來以手術治療結合以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點的分子靶向治療已經成為肺腺癌一種新的治療方案，以提高肺腺癌患者的生存質量和無瘤生存期。多項臨床研究顯示，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治療突變型肺癌的有效率可以高達50%[1-3]。靶向藥物治療肺腺癌的潛在臨床反應決定于肺癌患者EGFR突變，EGFR-TKI結構域的前4個外顯子（外顯子18～21）發生突變的患者對靶向藥物的反應較好，其中，外顯子19和21是肺癌患者體細胞的EGFR突變最常見的兩種類型[4]。

我們對符合入選標準的152例肺腺癌患者體細胞進行了EGFR外顯子19及2l基因測序，并分析腺癌EGFR突變的異質性與其臨床特征間的關系，從而為肺腺癌的臨床治療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集復旦大學附屬華山醫院152例NSCLCs患者手術切除腺癌組織標本。152例肺腺癌患者均有完整的臨床病理資料，患者術前均未經過放療、化療等治療。其中女77例，男75例，年齡22～78歲。突變肺腺癌臨床病理分期：Ⅰ期74例，Ⅱ期50例，Ⅲ期28例。1.2基因測序 ①取腫瘤組織30mg，先使用組織DNA抽提試劑盒（天根）對組織樣本進行DNA抽提，紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，然后根據測定的濃度將樣本稀釋到工作濃度5～10ng/ul；②引物設計與合成：擴增EGFR基因外顯子19及21引物設計[2]。針對Del E746-A753和L858R突變設計的特異引物，參照GenBank上的EGFR基因全序列檢索，反向引物同上述聚合酶鏈反應（PCR）常規引物，向引物針對突變設計為第19外顯子的上游引物為5'-AGCATGTGGCACCATCTCAC-3'，下游引物為5'- GCAGGGTCTAGAGCA GAGCAG-3'；第20外顯子上游引物為5'- CCCTCCTTCTGGCCACCAT-3'，下游引物為5'-TATCCCCATGGCAAACTCTTG-3'；引物由寶騰生物工程有限公司提供；③PCR擴增和基因測序：按照反應體系配制PCR反應體系，進行PCR擴增，Sanger測序法（ABI 3730）對PCR產物進行測序，得到結果。按照反應體系配制反應混合液，Taq-man ARMs探針法（ABI 7500）進行檢測分析，得到結果。

1.3統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件分析，應用列聯表，檢驗分析EGFR突變與患者性別、組織學類型和吸煙狀態及年齡之間的關系，P<0.05認為具有統計學差異性。

2 結果

2.1腺癌EGFR基因突變與患者臨床特征之間的關系 152例肺腺癌標本，共檢測到98例EGFR突變（64.5%），腺癌EGFR基因突變在女性患者中所占的比例（58.2%）顯著高于男性患者（41.8%），且具有統計學意義差異（χ2=5.177，P<0.05），而與患者年齡無關，見表1。

2.2腺癌EGFR基因突變的相關因素 Ⅰ期患者EGFR突變率為67.6%，Ⅱ期突變率為40%，Ⅲ期突變率為100%；EGFR突變率在不同臨床分期之間的差異有統計學意義（P<0.001）。82例非吸煙病例34例突變（41.5%），低于有吸煙病史的患者（57.1%）（P>0.05）。見表2。

在所有EGFR突變患者中，外顯子19突變的肺腺癌患者病理類型中：Ⅰ期有23例（51.1%），Ⅱ期12例（26.7%），Ⅲ期10例（22.2%），且具有統計學差異。外顯子21突變率在女性患者（60.4%）較男性患者（39.6%）高，且具有統計學意義（P<0.05）。外顯子21突變的肺腺癌患者病理類型中：Ⅰ期有6例（50.9%），Ⅱ期6例（15.1%），Ⅲ期4例（34.0%），且具有統計學差異。見表3。

2.3 EGFR基因突變情況 在152例肺腺癌標本中，我們共發現三種框架刪除突變，其中最常見的是2235_2249del GGAATTAAGAGAAGC，它直接導致5個氨基酸的缺失（E746-A750del）。在外顯子21，所有檢測到的突變均為2573位核苷酸的點突變（2573T-G），此突變導致精氨酸替代了亮氨酸（I58R）。

3 討論

EGFR-TKI治療NSCLCs已經取得了顯著進展，其治療肺癌的療效與EGFR基因突變有關。在EGFR突變的非小細胞肺癌患者中超過70%的患者對EGFR-TKI藥物敏感，相比之下，沒有EGFR突變的非小細胞肺癌患者中只有10%的患者對EGFR-TKI藥物敏感[5]。有研究顯示：女性、腺癌、遠處轉移、化療和吸煙指數等因素與NSCLC中EGFR基因突變相關[6]；在本研究中152例肺腺癌標本，共檢測到98例EGFR突變（64.5%），在所有病例中有57例女性突變（58.2%），明顯高于男性患者的突變率（41.8%），且具有統計學意義差異（χ2=5.177，P<0.05）。然而，本研究中是否吸煙這一因素無顯著相關性，與文獻不符，可能的原因是入組樣本量較小，近幾年女性患者吸煙人數增加，造成納入實驗組的吸煙人數比例與對照組基本近似，造成吸煙這一因素無顯著性差異[7]。

EGFR突變在不同的臨床病理分期之間有顯著差異，以肺腺癌的Ⅰ期多見，說明能夠早期發現的肺腺癌中，突變比例明顯增高；中晚期的肺腺癌患者，因為較容易轉移的特征，發現時已經沒有手術指征，所以分期較晚的患者，突變比例低。

EGFR突變主要發生在外顯子18-21，使用GFR-TKI藥物治療伴有EGFR不同突變類型的患者，其臨床療效也有明顯區別，其療效與EGFR基因外顯子18、19和21（編碼胞內酪氨酸激酶活性區域）的突變有關[8-9]。在本研究中，外顯子19突變為45例（45.9%），外顯子21突變為53例（54.1%）。

綜上所述，本研究顯示，肺腺癌中的EGFR基因突變發生率占64.5%，其中，外顯子19和21位點突變率分別為45.9%和54.1%。EGFR基因突變以Ⅰ期多見，其中以第21號外顯子的突變較為常見。

參考文獻：

[1]Lynch，T.J.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J].N Engl J Med，2004，350（21）：2129-2139.

[2]Paez，J.G.EGFR mutations in lung cancer：correlation with clinical response to gefitinib therapy[J].Science，2004，304（5676）：1497-1500.

[3]Pao，W.EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from\"never smokers\"and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（36）：13306-13311.

[4]Bublil，E.M.and Y.Yarden，The EGF receptor family：spearheading a merger of signaling and therapeutics[J].Curr Opin Cell Biol，2007，19（2）：124-134.

[5]Uramoto，H.and T.Mitsudomi，Which biomarker predicts benefit from EGFR-TKI treatment for patients with lung cancer[J].Br J Cancer，2007，96（6）：857-863.

[6]Smits，A.J.，et al.，EGFR and KRAS mutations in lung carcinomas in the Dutch population：increased EGFR mutation frequency in malignant pleural effusion of lung adenocarcinoma[J].Cell Oncol（Dordr），2012，35（3）：189-196.

[7]姜斌，等.中國人非小細胞肺癌EGFR基因突變的研究[J].上海第二醫科大學學報，2005（11）：61-63.

[8]Cappuzzo，F.，et al.，Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer[J].J Natl Cancer Inst，2005，97（9）：643-655.

[9]Gangjee，A.，et al.，Design，synthesis and biological evaluation of substituted pyrrolo[2，3-d]pyrimidines as multiple receptor tyrosine kinase inhibitors and antiangiogenic agents[J].Bioorg Med Chem，2008，16（10）：5514-5528.編輯/哈濤

Key words：Epidermal growth factor receptor；Non-small cell lung cancer；Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor；Gene mutation