糖尿病胃輕癱大鼠模型制作的實驗研究

糖尿病胃輕癱大鼠模型制作的實驗研究

*通信作者 E-mail:1092175568@qq.com

網絡出版時間：2015-09-11網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2255.020.html

柏曉輝1， 管志敏1， 潘艷伶2*

(1.貴州醫科大學， 貴州 貴陽550001； 2.貴州醫科大學 中醫科， 貴州 貴陽550001)

[摘要]目的： 探討小劑量鏈脲佐菌素注射液(STZ)聯合高能量飲食法誘導糖尿病胃輕癱(DGP)大鼠模型。方法： 將24只大鼠隨機均分為正常組和模型組，正常組大鼠予普通飼料喂養，模型組大鼠予高脂高糖喂養，模型組大鼠高脂高糖喂養4周后，予1% STZ溶液腹腔注射3次，劑量分別為20、25、35 mg/kg，第3次注射后4周測大鼠空腹血糖、胃內殘留率、血清胃動素(MLT)、胃泌素(GAS)，同時取大鼠胃組織，觀察胃竇平滑肌細胞。結果： 模型組大鼠空腹血糖、胃內殘留率、MLT、GAS明顯高于正常組，差異具有統計學意義(P<0.01)；模型組大鼠胃竇平滑肌細胞形態學改變較正常組大鼠有明顯差異。結論： 小劑量STZ聯合高能量飲食法可成功復制DGP大鼠模型。

[關鍵詞]糖尿病； 胃輕癱； 動物，模型； 大鼠； 鏈脲佐菌素，小劑量； 高脂高糖食物

[中圖分類號]R573.9； R587.1

Experimental Study on the Model of Diabetic Gastroparesis Rat

BAI Xiaohui1, GUAN Zhimin1, PAN Yanling2

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,

theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550001,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate the establishment of rat model of diabetic gastroparesis (DGP) by low dose of STZ combined with high energy diet. Methods: Twenty-four rats were randomly divided into normal group and model group, 12 rats in each group. Rats in normal group were fed with common diet while rats in model group were fed with high energy diet. After four weeks of high energy diet feeding, rats in model group received intraperitoneal injection of low dose of STZ solution three times, 20, 25, 35 mg/kg respectively. Four weeks after the third injection, FBG level, the gastric emptying rate, serum MLT, GAS content of rats were detected. And the gastric tissue of rats was taken out to observe morphological changes of gastric smooth muscle cell. Results: The FBG level, gastric emptying rate, serum MLT and GAS content of rats in model group were significantly higher than their counterparts in normal group (P<0.01). The morphological changes of gastric smooth muscle cell in model group were different from those in normal group. Conclusion: Low dose of STZ combined with high energy diet can successfully establish the rat model of DGP.

[Key words] diabetes mellitus; diabetic gastroparesis; animals model; rat; streptozotocin,small dose; high energy diet

隨著糖尿病發病率的持續上升[1]，糖尿病胃輕癱(DGP)發生率也呈現迅猛增長的勢頭。據國內外相關資料統計，50%～76%糖尿病患者并發胃輕癱，特別在晚期糖尿病患者中高達75%[2-3]。為深入研究本病的防治，建立一種理想的動物模型十分必要。本文對小劑量鏈脲佐菌素注射液(STZ)聯合高能量飲食法建立大鼠DGP模型進行了研究，報告如下。

1材料與方法

1.1動物與材料

SPF級SD大鼠,健康雄性24只，體重(200±20)g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供,實驗動物許可證號SCXK(黔)2002-0001。本實驗所用STZ由美國Sigma公司生產，大鼠胃動素(motilin，MLT)酶聯免疫分析試劑盒、大鼠胃泌素(gastrin，GAS)酶聯免疫分析試劑盒，均購于昆明騰昆科技有限公司。普通飼料配方：碳水化合物50%，脂肪10%，蛋白質20%。高能量飼料配方：碳水化合物61%，脂肪14%，蛋白質14%，蔗糖10%，膽固醇1%。

1.2方法

將24只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組(12只)、模型組(12只)，正常組予普通飼料喂養，模型組大鼠予高能量飼料喂養，連續4周；4周后模型組大鼠經腹腔注射0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配制STZ溶液，劑量為20 mg/kg，72 h后尾靜脈取血測空腹血糖>16.7 mmol/L為模型組[4]。首次造模后12只大鼠空腹血糖均未達糖尿病標準，未有死亡；第二次予25 mg/kg劑量腹腔注射STZ溶液，72 h后測空腹血糖仍未達標(較首次空腹血糖明顯升高)，未有死亡；第3次予35 mg/kg劑量腹腔注射STZ溶液，72 h后測空腹血糖有11只大鼠血糖達標，1只死亡。正常組經腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。實驗期間所有大鼠隨意飲水。

1.3檢測指標

在實驗結束處死大鼠前禁食不禁水24 h，處死大鼠30 min前予半固體糊狀物(羥甲基纖維素5 g、奶粉8 g，糖4 g，淀粉4 g，加水125 mL配成約150 g糊狀物)2 mL/只進行灌胃；30 min后股動脈采血處死大鼠，每只大鼠取血5 mL，標本靜置30 min后，以3 000 r/min離心10 min，分離出血清，用酶聯免疫法檢測MLT、GAS含量，標本處理及操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。處死大鼠后隨即剖腹取胃(將噴門和幽門結扎后剪斷)，拭凈，稱胃全重，沿胃大彎將其剖開，除去胃內容物、清洗胃后拭干再稱其重量，測胃內殘留率[5]，胃內殘留率=(胃全重-胃凈重)/糊重×100%。取胃竇組織約10 mm×2 mm，放入10%福爾馬林液固定病理切片，觀察胃竇平滑肌細胞形態。

1.4統計學方法

2結果

2.1造模后空腹血糖、胃內殘留率

模型組大鼠造模后空腹血糖及胃內殘留率較正常組明顯升高(P<0.01)，證明本實驗復制DGP大鼠成功。見表1。

表1　兩組大鼠造模后空腹血糖及

(1)與正常組比較，P<0.01

2.2血清MLT、GAS含量

由表2可見，模型組大鼠血清MLT、GAS含量較正常組顯著升高(P<0.01)，通過胃腸激素水平進一步證明本實驗大鼠DGP模型復制成功。

表2　兩組大鼠血清MLT及GAS含量比較

(1)與正常組比較，P<0.01

2.3胃竇平滑肌細胞形態

正常組大鼠胃竇平滑肌細胞多呈梭形，細胞核規則，呈長橢圓形，核膜相對平滑，褶皺少而淺，異染色質分布均勻，胞質內密斑、密體明顯，肌絲清晰可見。模型組大鼠胃竇平滑肌細胞變小，細胞核不規則、核膜皺縮明顯，染色質呈致密塊狀，深染、邊聚，密體、肌絲減少。見圖1。

3討論

2011年全世界糖尿病患者約3.66億人，比2010年增加了0.8億多，提升近30%，統計當年每1 min約有10人死于糖尿病并發癥[6]。作為糖尿病常見慢性并發癥之一，DGP不僅能引起病人血糖控制不佳，還可誘發機體營養不良及內環境紊亂，導致全身衰竭，加劇病情惡化[7]。 DGP的發展將嚴重影響糖尿病其他并發癥的發生與進展，DGP不僅是患者關注的焦點，也是醫學工作者研究的熱點，復制DGP大鼠模型對研究糖尿病引起的DGP的發生機制及有效治療十分重要。

正常組　　　　　　　　　　　　　　　　　模型組 圖1　正常組和模型組大鼠胃竇平滑肌細胞(HE, ×100) Fig.1　Comparison of morphological changes of smooth muscle cell of sinuses ventriculi

目前，DGP大鼠造模主要有實驗誘導法和自發性糖尿病模型，因自發性動物模型價格昂貴，且造模過程時間長，所需飼養條件及飼料要求嚴格而難以得到進一步推廣，故在實驗研究中，主要常用實驗誘導法。實驗誘導法又包含特殊膳食誘導和化學藥物誘導兩種，特殊膳食主要以高能量飼料為主。Chalkley等[8]發現，用高能量膳食誘導健康動物一定時間后可出現胰島素抵抗，但不能達到高血糖，即便能誘導出高血糖模型也需要比較長的時間，大概半年到兩年不等。Maria等[9]用高脂肪食料飼養小鼠，1年后觀察到小鼠葡萄糖耐受試驗明顯異常，且發現胰島素量代償性增加，可但空腹血糖變化不大。化學藥物誘導DGP模型的應用較多的試劑有STZ和四氧嘧啶(ALX)，STZ、ALX均能有目的性的破壞哺乳動物胰島β細胞。ALX價廉，造模過程中動物的死亡率較高，注射后動物對其有依懶性；而STZ雖價格比ALX稍高，但其誘導的模型較穩定，死亡率低，故實驗研究中用STZ較廣泛。目前動物實驗使用STZ造模的主要有兩種方式，一種是單次大劑量注射STZ[10-12]，可使動物血糖迅速升高，適合短時間內需求高血糖動物模型的實驗所用，此種造模方式復制的動物模型更類似1型糖尿病，但單次大劑量注射STZ后會使動物血糖過高，極易發生酮癥死亡，故此種方法造模的死亡率亦偏高，且動物模型不穩定；另一種方法是多次小劑量腹腔注射STZ溶液，可使血糖水平逐步上升，但此種方法是通過直接破壞胰島β細胞實現的，而與人類DGP發生過程差距較大。在復制糖尿病胃輕癱模型的研究中較多使用的有ALX聯合熟地灌胃以及小劑量STZ聯合高能量飲食喂養兩種。

本實驗采用特殊膳食和化學藥物聯合誘導的造模方式，共分為兩期，第一期即特殊膳食誘導期，予大鼠高能量飼料喂養，4周后高能量喂養的模型組大鼠體重明顯增加，這一期大鼠的狀況接近人類糖尿病前期的脂代謝紊亂期；第二期為化學藥物誘導期，特殊膳食4周后，給大鼠小劑量鏈脲佐菌素溶液腹腔注射3次，逐漸破壞大鼠胰島β細胞。運用化學藥物加速胰島β細胞的破壞，使其在病理機制上更接近于人類DGP發生發展過程。本實驗以空腹血糖和胃內殘留率作為檢測造模成功的指標，模型組大鼠空腹血糖明顯升高、胃內殘留率升高，組織細胞圖片顯示胃竇平滑肌細胞的輕微改變，血清MLT、GAS水平升高，證實復制DGP模型成功，且造模過程中大鼠存活率達91.67%，表明本實驗造模方法可獲得研究糖尿病DGP動物模型。

4參考文獻

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(2015-06-01收稿，2015-08-11修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華