斯鈣素1對腎癌細胞生長調控的影響

斯鈣素1對腎癌細胞生長調控的影響*

**通信作者 E-mail:18985009566@189.cn

網絡出版時間：2015-09-11網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2325.066.html

楊清滔1， 谷江2*， 石家齊1， 賈本忠1， 顧昌世1， 張永春2， 朱致暉3， 姚茂良2， 劉淼2， 夏劍鋒2

(1.貴州醫科大學附屬白云醫院， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫科大學附屬醫院， 貴州 貴陽550004； 3.貴州省婦幼保健院， 貴州 貴陽550000)

[摘要]目的： 研究斯鈣素1(stanniocalcin1, STC-1)對腎癌細胞生長的調控機制。方法： 體外培養腎癌細胞，用0、0.1、0.5和1.0 nmol/L STC-1溶液浸染腎癌細胞，分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組；分別用MTT法檢測各組腎癌細胞的增殖情況，RT-PCR及ELISA法檢測各組腎癌細胞中缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、STC-1基因及蛋白的表達，熒光分光光度計檢測各組細胞內Ca2+水平。結果： 隨著STC-1蛋白給藥濃度的增加，細胞內HIF-1α、STC-1的表達及Ca2+水平逐漸下降，細胞的促增殖作用逐漸降低，在低劑量組出現一過性增加。結論： STC-1蛋白可能通過調節HIF-1α、Ca2+的水平，促進腎癌細胞增殖，而該促增殖作用可能會因為STC-1對HIF-1α的抑制而逐漸減弱，從而調控腎癌細胞的生長平衡。

[關鍵詞]腎癌細胞； 斯鈣素1； 缺氧誘導因子1α； 鈣離子； 增殖； 抑制

[基金項目]*貴州省科技廳社會攻關計劃項目[黔科合sy字(2011)3060]

[中圖分類號]R737.11

Influence of STC-1 on Growth Regulation of Renal Carcinoma Cells

YANG Qingtao1, GU Jiang2*, SHI Jiaqi1, JIA Benzhong1, GU Changshi1, ZHANG Yongchun2,

ZHU Zhihui3, YAO Maoliang2, LIU Miao2, XIA Jianfeng2

(1.AffiliatedBaiyunHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Affiliated

HospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.WomenandChild

HealthHospitalofGuizhouProvice,Guiyang550004,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To research the regulation machenism of Stanniocalcin1 (STC-1) on renal carcinoma cells. Methods: Renal carcinoma cells were cultured in vitro, and STC-1 solutions of different concentration were added to the culture medium. According to the different concentration, renal carcinoma cells were divided into control group, low-dose group (0.1 nmol/L STC-1), middle-dose group (0.5 nmol/L STC-1), high-dose group (1.0 nmol/L STC-1). The proliferation of cells, expressions of HIF-1α, STC-1 and levels of Ca2+ were detected by MTT, RT-PCR, ELISA and Fluorescence Spectrophotometer respectively. Results: The results showed that the cells treated with STC-1 protein exhibited characteristics of proliferation. And along with the increase of STC-1 protein concentration, the proliferation of cells, expressions of HIF-1α and STC-1, levels of Ca2+ were down-regulated. And a transient increase of proliferation of cells occurred in the low-dose group. Conclusions: STC-1 protein may participate in malignant proliferation of renal carcinoma cells through depressing HIF-1α or down-regulation Ca2+, which could wear off when HIF-1α is inhibited by redundant STC-1, thus regulate the growth balance of renal carcinoma cells.

[Key words] renal carcinoma cells; stanniocalcin1; hypoxia-inducible factor 1α; calcium; proliferation; inhibition

惡性腫瘤由于其侵襲性和異型性等特性，在發生發展過程中腫瘤細胞會激活一系列相關分子信號轉導途徑以適應環境的變化[1]。缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)作為介導細胞進行適應性反應的關鍵性轉錄調控因子，在維持腫瘤細胞的能量代謝、細胞增殖等方面發揮重要作用[2]。斯鈣素1(stanniocalcin1, STC-1)是一種高表達于腎小管上皮細胞、調節細胞內Ca2+平衡的糖蛋白激素[3]，在多種實體瘤組織內高表達[4]。Ca2+的動態平衡與腫瘤細胞增殖、轉移和侵襲有關[5]，HIF-1α亦是誘導STC-1表達的關鍵調節因子[6]。本實驗選擇HIF-1α、Ca2+為研究靶點，以外源性STC-1蛋白作為干預條件，通過檢測細胞內HIF-1α、STC-1基因及蛋白表達和Ca2+水平的變化，探討STC-1是否借助調節細胞內Ca2+及HIF-1α水平參與腎癌細胞的生長調控。

1材料與方法

1.1主要材料

腎癌(GRC-1)細胞購于上海弗雷堡生物公司，MTT購于Sigma公司，RPMI1640購于Hyclone公司，STC-1蛋白購于Prospec公司，總RNA提取試劑盒購于Fermentas公司，ELISA試劑盒購于R&D公司，Fura-2 AM鈣離子探針購于碧云天生物技術研究所。

1.2細胞培養及分組

GRC-1細胞置于25 cm2培養瓶中，用含10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養液，在5% CO2、37 ℃培養，2～3 d換液或消化傳代1次，取生長對數期細胞進行試驗。用0、0.1、0.5和1.0 nmol/L STC-1溶液浸染細胞培養基，即為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。

1.3方法

1.3.1HIF-1α、STC-1基因檢測RT-PCR法檢測細胞內HIF-1α、STC-1基因表達。使用試劑盒提取各組腎癌細胞總RNA，取1 μg RNA進行逆轉錄并合成cDNA。引物序列β-actin，正向5′-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3′，反向5′-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3′，片段長度531 bp；HIF-1α，正向5′-TCCA GCAGACTCAAATACAAGAAC-3′，反向5′-GTATGTGGGTAGGAGATGGAGATG-3′，片段長度130 bp；STC-1，正向5′-TGAGGTCGTCCAGCTCCCAATC-3′，反向5′-GGCACAGTGGTCTGTCTGCAGGATG-3′，片段長度142 bp。RT-PCR反應條件：預變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35個循環后，終止反應72 ℃ 5 min；以β-actin作為內參照，PCR產物于2%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.3.2HIF-1α、STC-1蛋白的檢測ELISA法檢測HIF-1α、STC-1蛋白表達。使用PMSF與細胞裂解液裂解各組細胞，12 000 r/min離心5 min，取上清滴加于酶標包被板中，50 μL/孔，分別設空白孔、標準孔和待測樣品孔，按照試劑盒說明書操作。

1.3.3Ca2+含量測定熒光探針檢測細胞內Ca2+含量。取生長良好的細胞接種于6孔板中，當匯合度約80%時，分組處理后消化成細胞懸液，1 000 r/min離心5 min棄上清液，用含0.2%小牛血清白蛋白的D-Hanks液重懸細胞，調整細胞數約為8×105/mL。加入Fura-2 AM(3.89 μmol/L)，37 ℃避光孵育45 min。用D-Hanks液洗滌細胞2次，D-Hanks液3 mL重懸細胞。熒光分光光度計激發波長分別為340 nm、380 nm，發射波長510 nm雙波長測定負載探針細胞的熒光強度。加入158 μL 2%Triton-100，5 min后測定細胞雙波長熒光強度；加380 nmol/LEGTA 42 μL測定細胞雙波長熒光強度。所得結果按公式計算：[Ca2+] =224×F0/Fs×(R-Rmin)/(Rmax-R)[R為實驗測得的F340/F380，Rmax為加入Triton-100后的F340/F380，Rmin為加入Triton-100后再加EGTA的F340/F380，Fs為加入Triton-100后的F380，F0為加入Triton-100后再加EGTA的F380]。

1.3.4細胞增殖活性MTT法檢測細胞的增殖活性。取生長良好的細胞接種于96孔板中，約104個/孔，每組設6復孔，培養24 h分組處理后吸取孔內培養基，每孔加80 μL無血清培養基和MTT(5 μg/L) 20 μL，37 ℃孵育4 h后棄去孔內液體，加二甲亞砜150 μL低速震蕩10 min，用酶標儀檢測490 nm處的吸光度(OD)值。

1.4統計學方法

2結果

2.1HIF-1α和STC-1基因的表達

各劑量組HIF-1α、STC-1基因的表達量均顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著STC-1劑量的增加而逐漸降低。見圖1。

2.2HIF-1α和STC-1蛋白相對表達水平

除低劑量組外，各劑量組HIF-1α、STC-1蛋白的表達量均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注： MarkerⅠ為100～600 bp作為標準參照； (1)與對照組相比，P<0.05 圖1　各組細胞內HIF-1α、STC-1基因相對表達水平 Fig.1　Relative expression of HIF-1α and STC-1 genes in each group

(1)與對照組相比，P<0.05 圖2　各組細胞內HIF-1α、STC-1蛋白相對表達水平 Fig.2　Relative expression of HIF-1α and STC-1 proteins in each group

2.3細胞內Ca2+含量及細胞增殖活性

STC-1低、中、高劑量組細胞內Ca2+含量均顯著低于對照組(P<0.05)，且細胞內Ca2+含量均隨STC-1給藥濃度的增加而逐漸減少；除高劑量組外，低、中、高劑組細胞OD值均高于對照組，但隨著STC-1劑量的增加OD值逐漸下降，差異有統計學意義(P<0.05)，在低劑量組出現一過性增加。見表1。

表1　各組細胞內Ca 2+含量及細胞增殖活性

(1)與對照組相比，P<0.05

3討論

惡性腫瘤發生發展在很大程度上依賴HIF-1α來維持腫瘤細胞的能量代謝、新血管形成、細胞增殖[2]。HIF-1α表達的增減可使腫瘤細胞生長、血管化和轉移出現相應的增減，最終影響患者預后[7]。STC-1高表達于腎小管上皮細胞，調節細胞內Ca2+平衡[3]，而Ca2+作為細胞內重要的第二信使，參與了多種腫瘤細胞的增殖及凋亡調控[8]。隨著對STC-1不斷深入研究，發現STC-1在腫瘤生長過程中發揮著重要作用，原因可能與STC-1調節細胞內Ca2+含量，從而誘導細胞增殖有關[5]。鑒于HIF-1α、STC-1及Ca2+之間的相互聯系，故本研究選擇HIF-1α、Ca2+為研究靶點，用不同濃度STC-1干預腎癌細胞，通過檢測細胞HIF-1α、STC-1表達和Ca2+水平的變化，探討STC-1是否借助調節細胞內Ca2+及HIF-1α水平參與腎癌細胞的生長調控。

本研究中，STC-1干預腎癌細胞后，發現HIF-1α、STC-1表達隨著STC-1給藥濃度的增加而逐漸下降，這可能是外源性STC-1蛋白經胞質轉導肽(CTP)介導，被其導入細胞內，其中CTP是一種可攜帶生物活性大分子轉運到細胞質的新型轉導肽[9]，被導入的STC-1發揮其有效蛋白作用，并下調細胞內HIF-1α表達[10]，亦可能是STC-1蛋白直接作用于細胞后的負反饋調節所致。本研究結果顯示STC-1可下調細胞內Ca2+含量，且隨著STC-1給藥濃度的增加而逐漸降低。相關文獻報道，HIF-1α、STC-1降低Ca2+機制不盡相同；一方面HIF-1α通過上調細胞內質網鈣泵SERCA2蛋白表達和增強線粒體Ca2+緩沖能力，促進細胞內Ca2+向內質網、線粒體轉移，并且下調細胞膜非典型L型鈣通道表達，從而引起Ca2+內流減少[11]；另一方面可能是由于STC-1分泌細胞上存在鈣離子敏感受體，從而介導STC-1分泌細胞合成和分泌STC-1，進而負反饋降低Ca2+[12]。結合本研究MTT結果，發現STC-1能促進腎癌細胞增殖，而促增殖作用卻隨著STC-1給藥濃度的增加而降低，其原因可能為隨著STC-1給藥濃度的增加，HIF-1α、Ca2+水平逐漸下降，細胞增殖活性升高可能是通過STC-1濃度的增加來減少細胞內Ca2+含量，避免鈣超載，從而抑制細胞凋亡；但HIF-1α是促腫瘤細胞生長的有利基因[7]，STC-1降低Ca2+的同時也降低HIF-1α，當HIF-1α表達下降到一定程度時，STC-1對細胞的增殖促進作用逐漸被HIF-1α表達下降所拮抗；故STC-1對細胞促增殖的作用在低劑量組出現一過性增高，在中、高劑量組逐漸降低。

惡性腫瘤是消耗性疾病，腫瘤細胞對能量需求過大或供給不足都將導致細胞生長受限。HIF-1α是促腫瘤細胞增殖的有利因子[7]，而STC-1蛋白卻抑制其表達，這避免了腫瘤細胞過度增殖而減少能量消耗，表明STC-1可能作為腫瘤細胞增殖的調節劑或緩解劑。一方面STC-1通過降低細胞內Ca2+水平，避免鈣超載，減少細胞凋亡，從而實現細胞增殖；另一方面STC-1通過下調HIF-1α表達，避免細胞過度增殖，最終使細胞達到一種平衡生長狀態。嘗試打破這一生長平衡可為臨床對腎癌的治療帶來新的思考，但腫瘤細胞生長過程受多因素調控，本研究僅為體外實驗，尚不能更真實的模擬細胞生長環境，故在后續實驗中我們將建立動物模型并選擇性沉默或高表達STC-1，深入研究STC-1作用于腫瘤細胞及機制。

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(2015-05-12收稿，2015-08-23修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

注意正確使用“百分點”

百分點(1百分點=1%)的使用現在越來越多，但不少媒體用錯了。例如某期刊中說：“2007年產量為100萬t，2008年達112萬t，增加了12個百分點?！?/p>

百分點是一個新的基礎數學概念，它只用于比較采用百分數形式表示的數值的增減 ，例如個人存款的年利率從3.25%降至2.25%，可以說降了1百分點，但決不能說降了1%。如果是降了1%，則新利率應為3.25%～3.25%×0.01=3.217 5%。可見，上述年產量的增加應用百分數表示，即說“增加了12%”。

百分點是一個單位，書寫時其前面的“個”應刪去，正如“5小時”“10厘米”不應寫作“5個小時”“10個厘米”一樣。