慢性氟中毒大鼠血細胞MGMT與hMLH1基因mRNA的表達

·特約專論·

慢性氟中毒大鼠血細胞MGMT與hMLH1基因mRNA的表達*

**通信作者 E-mail:xiaolan76@163.com

網絡出版時間：2015-09-11網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2319.058.html

王煜蘅1， 蘇艷麗2， 吳昌學1， 李毅1， 官志忠1,3， 齊曉嵐1**

(1. 貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽護理職業學院 檢驗系， 貴州 貴陽 550081； 3. 貴州醫科大學 病理學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究慢性氟中毒大鼠血細胞中O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶基因(MGMT)及錯配修復基因(hMLH1)mRNA表達水平。方法： 采用飲水加氟法復制20只慢性氟中毒大鼠模型為染氟毒組，另取20只大鼠飲用含氟量<0.5 mg/L自來水為對照組，兩組大鼠飼養6月時，觀察大鼠氟斑牙的形成，鑒定染氟是否成功，同時采取股動脈放血處死大鼠，提取大鼠血細胞總RNA ，實時熒光定量 PCR 法檢測染氟毒組及對照組大鼠 MGMT、hMLH1基因 mRNA 水平。結果： 染氟組20只大鼠全出現氟斑牙，表明染氟成功；氟中毒大鼠血液 MGMT、hMLH1 基因mRNA 表達水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論： MGMT和 hMLH1 mRNA水平降低可能是氟中毒引起DNA損傷的機制之一。

[關鍵詞]O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶基因； 錯配修復基因； 氟化物中毒，慢性； 大鼠,Sprague-Dawley； 模型，動物

[基金項目]*國家科技支撐計劃項目(2013BAI05B03); 國家自然科學基金資助項目(81160335); 貴州省科技廳重點項目 [黔科合計Z 字(2012)4010]; 貴州省科技廳國際合作項目[黔科合外G字(2011)7014]; 貴州省科技廳科技計劃項目 [黔科合LG字(2012)009]

[中圖分類號]R599.5； R34-33

The Changes of Expression ofMGMTandhMLH1 mRNA

Levels in the Blood Cells of Chronic Fluorosis Rats

WANG Yuheng1, SU Yanli2， WU Changxue1, LI Yi1, GUAN Zhizhong1, QI Xiaolan1

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Department

ofLaboratoryScience,GuiyangNursingVocationalCollege,Guiyang550081,Guizhou,China; 3.Department

ofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate the effects of chronic fluorosis on the DNA repair gene O6-methyl-guanine-DNA methyl-transferase (MGMT) and human mismatch repair gene(hMLH1) mRNA levels in blood cells. Methods: Establish the model of chronic fluorosis rats by adding sodium fluoride to the drinking water of 20 fluorosis rats, and another 20 rats take the water with fluoride content less than 0.5 mg/L as control group. After raising them for 6 months then executing them by bleeding femoral artery, collect their arterial blood and extract the RNA, detect mRNA expression level of MGMT, MLH1 gene from each group by real-time fluorescence quantitative PCR. Results: All 20 rats in experiment group showed signs of dental fluorosis, indicating successful fluoride results. The levels of MGMT and MLH1 mRNA were decreased, the transcription difference between the experimental group and control group had statistic value (P<0.05). Conclusion: MGMT mRNA and hMLH1 mRNA expression in the experimental group decrease significantly than the control group, and the reduction might be the reason in the mechanics of DNA injury.

[Key words] O6-methyl-guanine-DNA methyl-transferase; mismatch repair gene; fluorosis,chronic；rats, Sprague-Dawley; models, animal

氟作為一種固有化學物質存在于自然環境，是機體必需的微量元素，但長期或過量的攝入又會導致機體損傷，尤其是造成氟斑牙和氟骨癥等骨相損害。有研究表明，氟對中樞神經系統、腎臟、肝臟、甲狀腺以及心血管系統都有不同程度的損傷[1]。大量有關氟對DNA損傷的研究，揭示了氟在一定劑量時，可誘導口腔黏膜、肝、神經、生殖、成骨細胞等的DNA損傷[2-3]，氟的DNA損傷與氟的骨相以及非骨相損傷的關系已成為研究的熱點，并認為氟化物可以抑制DNA的合成、DNA單鏈斷裂及 DNA氧化損傷[4]。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methyl-guanine-DNA methyl-transferase,MGMT) 基因以及錯配修復(Mismatch repair gene,MLHl) 基因是DNA修復系統中重要的基因，本研究采用實時熒光定量PCR (Real Time-PCR)方法對慢性氟中毒大鼠的血液樣本進行檢測，觀察此類基因與氟中毒的關系。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

Trizol (Invitrogen)，異丙醇，氯仿，SYBR Green(bio-rad)，逆轉錄試劑盒(Invitrogen)，DU640 核酸蛋白分析儀，ABI Step one 型Realtime PCR儀。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物與分組清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠(貴州醫科大學動物實驗中心提供)，體質量100～120 g，隨機分為對照組和染氟毒組， 20只/組，組內大鼠雌雄各半，用動物實驗中心配制的標準飼料喂養，對照組飲用自來水，含氟量低于0.5 mg/L；染氟組飲用加入氟化鈉(sodium fluoride，NaF)含量為50 mg/L的自來水。動物室溫度約22 ℃，相對濕度約60 %；兩組大鼠飼養6月時，觀察大鼠氟斑牙形成鑒定染氟是否成功，同時采取股動脈放血方式處死大鼠，收集血細胞，于-80 ℃保存，測定MGMT、MLH1 基因 mRNA 水平。

1.2.2氟斑牙檢查采用三度法檢查氟斑牙形成情況[5]。Ⅰ度，門牙表面黃白相間，白奎條紋清晰； Ⅱ度，牙表面呈無光澤、粉筆樣白色斑; Ⅲ度，牙表面出現小溝、裂紋或部分脫落，牙齒呈鋸齒狀缺損。根據氟斑牙情況確定動物模型復制是否成功。

1.2.3MGMT及hMLH1 mRNA測定 采用經典Trizol法提取大鼠血細胞總RNA，經核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度以及純度。A260/A280比值在1.9～2.1，取3 μg總RNA按照說明書進行逆轉錄合成cDNA，4 ℃保存。按表1設計MGMT、MLH1和內參β-actin引物，用 Real Time-PCR 測定MGMT及hMLH1的 mRNA 的水平。ABI Step One型實時熒光定量 PCR 儀采集待測基因及內參照 β-actin 擴增各 40 個循環熒光信號，以 Applied Biosystems SDS1.4 軟件進行熒光采集和數據分析。SDS1.4 軟件分析其 ΔΔCt 值及relative quantity(RQ)值，RQ=2-ΔΔCt。以 β-actin 為內對照，計算染氟毒組與對照組間mRNA和對照組的相對水平。 反應條件為：95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，40個循環95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1　 MGMT、 MLH1及 β- actin引物序列

1.3統計學方法

2結果

2.1氟斑牙分度

20例對照組大鼠氟斑牙分度均為0級，而染氟組均出現不同程度的氟斑牙，其中Ⅰ度6例，Ⅱ度7例，Ⅲ度7例。證明氟中毒大鼠模型復制成功。

2.2MGMT和MLH1 mRNA表達

MGMT和MLH1 mRNA 在染氟組大鼠中表達水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1及圖2。

注：A為MLH1，B為MGMT，C為β-antin 圖1　MGMT和MLH1基因熔解曲線與循環圖(Real Time-PCR) Fig.1　The melting curve and circular fluorescent signal of MGMT and MLH1 gene

(1)與對照組相比,P<0.05 圖2　兩組大鼠血液樣本 MGMT和MLH1基因 mRNA 表達水平 Fig.2　The mRNA expression of MGMT and MLH1 in the blood of fluorosis rats

3討論

氟性質活潑，氟化物可通過與哺乳動物DNA的共價結合而造成DNA損傷，如DNA單鏈斷裂、 DNA氧化損傷及程序外合成DNA等[5]。一般情況下，任何的DNA損傷，只要修復無差錯，則損傷不會發生，此過程依賴于生物體細胞內修復系統的完整與穩定，如果修復系統出現了問題，損傷得不到有效和及時的糾正，就可能導致DNA損傷引起的突變。所以，損傷的最終結果是修復與損傷共同作用、相互平衡所造成的，氟所造成的損傷有可能是加強了對DNA的損傷，也有可能是破壞了修復系統，或者兩者皆有。

DNA錯配修復(MMR)系統是生物進化過程中的保守基因，具有修復DNA錯配、維持基因組穩定降低自發性突變的功能，這一系統由一系列具有特異修復DNA堿基錯配功能的酶分子組成[6-7]，MLH1基因是錯配修復基因中較為重要的基因，它擔負著對錯配位點的識別和切除的功能，其功能缺陷使DNA復制時出現的錯配難以得到有效修復[8-10]。MGMT是一種高效的DNA直接修復酶，能修復DNA序列中的6-O- 甲基鳥嘌呤即烷化基團對細胞 DNA的損傷，達到保護細胞的作用，尤其與DNA烷基化損傷的修復密切相關，這是一種迅速的、直接的修復方式，在 DNA損傷修復的早期發揮了重要的作用[11-12]。

本研究結果顯示，慢性氟中毒大鼠血細胞MGMT、MLH1基因mRNA表達水平較對照組明顯降低(P<0.05)，提示過量氟有可能抑制MGMT、MLH1基因的表達，影響了機體的DNA錯配修復功能和烷基化基團對細胞DAN損傷的修復，導致DNA損傷，這可能是氟引起DNA損傷的分子機制之一。

4參考文獻

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(2015-06-23收稿，2015-08-20修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅