紅藻氨酸致癇大鼠海馬Cav-1、EphrinA2蛋白的變化及肉桂醛的干預作用

紅藻氨酸致癇大鼠海馬Cav-1、EphrinA2蛋白的變化及肉桂醛的干預作用

金玉玲臧兆平1羅海龍2李欣李玲3董紅梅

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探討肉桂醛對紅藻氨酸(KA)致癇大鼠海馬Cav-1和EphrinA2蛋白的影響。方法60只雄性Wistar大鼠隨機分成正常組、NaCl組、癲癇組、肉桂醛低劑量(25 mg/kg)組、肉桂醛中劑量(37.5 mg/kg)組及肉桂醛高劑量(50 mg/kg)組。癲癇組和肉桂醛治療組均采用大鼠腦右側海馬CA3區一次性注射1 μg/μl KA 1μl誘發癲癇發作，NaCl對照組注射等量NaCl溶液，觀察其行為學表現，Western印跡檢測各組大鼠海馬組織Cav-1和EphrinA2蛋白的表達。結果實驗性癲癇大鼠模型制作成功，肉桂醛各劑量組和癲癇組實驗動物全部達到點燃標準，肉桂醛治療組大鼠癲癇發作潛伏期延長，發作時間明顯縮短，發作級別降低。海馬區Cav-1和EphrinA2蛋白的表達在正常組與NaCl組無差異(P>0.05)；與NaCl組比較，癲癇組大鼠海馬Cav-1和EphrinA2蛋白表達均明顯增加(P<0.01)；肉桂醛各治療組大鼠海馬Cav-1和EphrinA2蛋白的表達低于癲癇組(P<0.05)，且與肉桂醛濃度有關。結論KA海馬區注射可獲得穩定的癲癇大鼠模型，肉桂醛通過降低大鼠海馬Cav-1和EphrinA2蛋白的表達，起到抗癲癇作用。

關鍵詞〔〕癲癇；肉桂醛；小窩蛋白-1；EphrinA2

中圖分類號〔〕R742.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：黑龍江省教育廳項目(No.12521572)

1齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院

2牡丹江醫學院附屬紅旗醫院3吉林省東豐縣醫院

第一作者：金玉玲(1969-)，女，副主任醫師，碩士生導師，主要從事腦損傷機制和防治的研究。

癲癇(EP)是一種最常見的世界性的神經系統難題，為多種病因引起的神經系統異常放電造成以突發性、暫時性腦功能失常為特征的腦功能障礙綜合征。EP患者需要長期服用抗EP藥物控制EP發作時間及頻率，但仍有20%左右的患者經長期正規藥物治療后仍難以控制而形成難治性EP，且目前抗EP藥物雖應用于臨床，但只是控制癥狀，長期應用可導致認知功能障礙等副作用。因此，尋求一種特異性強、副作用小的抗EP藥物具有十分重要的意義。肉桂醛具有抗菌、降低血糖和抗腫瘤等作用〔1，2〕，但在EP方面的研究甚少。

1材料和方法

1.1試劑兔抗小窩蛋白(Cav)-1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，兔抗EphrinA2多克隆抗體購自武漢博士德生物技術有限公司；牛血清白蛋白和紅藻氨酸(KA)購自美國sigma公司；碘化丙啶(PI)和異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組60只成年健康雄性Wistar大鼠，3～5月齡，體重200~250 g，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供(許可證號：醫動字第09-2號)，分籠適應喂養>1 w。隨機將其分為六組，每組10只：EP組(大鼠CA3區注射KA致癲)，肉桂醛低劑量組 (大鼠CA3區注射KA致癲，連續7 d腹腔予肉桂醛25 mg/kg)，肉桂醛中劑量組 (大鼠CA3區注射KA致癲，連續7 d腹腔予肉桂醛37.5 mg/kg)，肉桂醛高劑量組 (大鼠CA3區注射KA致癲，連續7 d腹腔予肉桂醛50 mg/kg)，正常組(大鼠CA3區不注射)，NaCl組(大鼠CA3區注射NaCl，連續7 d腹腔給等量NaCl溶液)。

1.2.2動物模型制備Wistar大鼠以10%水合氯醛0.3~0.4 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上，按照Paxinos&Watson大鼠腦立體定向圖譜，以前囟為靶點定位：X=2.5 mm(右)，Y=3.0 mm，Z=3.5 mm；根據前囟標記點和Paxinos&Watson腦功能定位圖譜鉆孔，并參照大鼠的顱骨解剖圖，穿刺海馬CA3區，無菌且實驗動物清醒條件下，用 1 μl微量注射器注入濃度為1.5 μg/μl的KA 1 μl(每次注射前以NaCl溶液新鮮配制)，注射藥物時間每次持續10~15 min，0.1 μl/1 min，留針5 min。根據KA誘發大鼠的行為學改變判定EP大鼠模型的建立。NaCl組相同部位等時注入等量的NaCl溶液。

1.2.3大鼠行為學觀察大鼠海馬局部注射KA或NaCl后，觀察行為學變化。EP大鼠發作行為學變化的分級標準：0級：正常行為狀態，無發作反應；Ⅰ級：咀嚼、眨眼、立須等口周及面部肌肉抽搐，濕狗樣顫動；Ⅱ級：以點頭運動為主要表現的頸部肌肉抽搐；Ⅲ級：前肢陣攣、抽搐；Ⅳ級：雙側前肢伸直，伴有身體的立起；Ⅴ級：跌倒和全身驚厥。Ⅲ級以下為復雜部分發作，Ⅳ級和Ⅴ級為全身強直陣攣發作〔3〕。注藥后立即進行行為學觀察，海馬局部注射KA的大鼠，在1 h內出現Ⅰ~Ⅴ級行為變化的歸為EP模型。

1.2.4Western印跡法進行蛋白測定海馬組織樣品蛋白裂解液與5倍上樣緩沖液混合，100℃變性5 min，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，40 V，電轉移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜。PVDF封閉過夜，Cav-1蛋白和EphrinA2蛋白兔源多克隆抗體37℃，2 h，辣根過氧化物酶標記二抗37℃，1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗。增強化學發光法(ECL)顯色試劑顯色，對照Marker記錄實驗結果。將結果進行拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.3統計學方法應用SPSS11.5軟件行t檢驗。

2結果

2.1行為學觀察注射KA后，麻醉未醒的30 min內，大鼠安靜，偶見眨眼、動須、面肌抽搐；蘇醒后，大鼠咀嚼、眨眼、動須、動耳(Ⅰ級)及點頭、翹尾(Ⅱ級)；繼之出現對側前肢陣攣(Ⅲ級)，雙側前肢陣攣(Ⅳ級)，四肢抽搐、跌倒(Ⅴ級)；在30~60 min出現EP持續狀態(SE)，每次發作時間持續數分鐘至數小時，反復多次。EP組及肉桂醛各用藥組大鼠每天注射KA后均有不同程度的EP發作表現，EP組實驗動物在注射KA后1~7 min內即開始發作，每次發作持續時間不等，在肉桂醛注射初期與EP組發作相仿，潛伏期稍長，用藥后期，潛伏期延長，發作時間明顯縮短，發作級別降低且少有大發作。正常組無任何異常行為表現。肉桂醛各用藥組和EP組均出現Ⅲ級以上多次EP發作，比較其潛伏期和到達重型發作時間有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠EP發作潛伏期、到達重型發作

與EP組比較：1)P<0.01：2)P<0.05

2.2EP大鼠海馬 Cav-1和EphrinA2蛋白的表達NaCl組和正常組Cav-1(0.51±0.05 vs 0.53±0.05)和EphrinA2蛋白(0.60±0.03 vs 0.60±0.05)的表達無差異(P>0.05)；EP組大鼠海馬Cav-1蛋白(0.86±0.03)和EphrinA2蛋白(0.82±0.04)的表達顯著高于NaCl組(P<0.01)；與EP組比較，肉桂醛低、中、高劑量組Cav-1蛋白(0.78±0.04、0.71±0.03、0.65±0.02)和EphrinA2蛋白(0.73±0.03、0.67±0.02、0.61±0.04)的表達明顯降低(P<0.05)。見圖1。

1：正常組；2：NaCl組；3：EP組；4：肉桂醛低劑量組；5：肉桂醛中劑量組；6：肉桂醛高劑量組 圖1　大鼠海馬組織 Cav-1和EphrinA2蛋白的表達

3討論

顳葉EP(TLE)是難治性EP的主要類型，是一種主要起源于內側顳葉的部分發作性EP。KA，即海人酸，首先由日本人從海藻中提取出來，其結構類似于谷氨酸，能產生很強的神經興奮作用。它可以與突觸后膜的海人酸受體(海馬CA3區的KA受體最多)結合，產生興奮性突觸后電流，導致動物EP發作，即為海人酸EP模型。KA模型是常用的EP持續狀態模型及自發發作模型〔4〕。本實驗直接將KA注射到雄性Wistar大鼠海馬CA3區，由于海馬病變引起的繼發性EP的行為癥狀、特異性的海馬損傷病理改變及復發的自發性抽搐，類似人類的顳葉EP，所以取CA3區為注射藥物的作用點更直接、更方便，也更容易出現顳葉EP的病理學改變。

EP腦損傷是EP發作的結果，也是EP頻發和難治的原因。肉桂醛是中藥肉桂油的主要成分，肉桂作為一種傳統中藥，具有鎮靜、鎮痛、解熱、抗驚厥等多種藥理作用〔5〕。本實驗KA通過行為學觀察發現，應用肉桂醛后，EP大鼠EP發作潛伏期延長，發作時間明顯縮短，發作級別降低且少有大發作，提示肉桂醛可減輕EP發作。

顳葉EP的病理基礎是苔蘚纖維出芽、異常興奮環路的形成〔6〕，引起神經元異常放電，增加EP發作的敏感性并促進EP的形成〔7〕。

Cav-1是細胞膜上小窩結構的基本結構蛋白，在小窩結構的維持、多種信號通路的調節中起重要作用。Cav-1不僅參與脂質代謝、調節細胞凋亡、介導內吞作用，還在腫瘤發病過程具有重要作用〔8，9〕。Caveolin蛋白在神經系統中分布廣泛，脊髓、底丘腦核、黑質、尾狀核和海馬等部位的神經細胞和神經膠質細胞中均有Cav-1的表達〔10〕。Cav-1與腦功能的生理和病理變化有關，影響神經發育、突觸可塑性等過程〔11〕，且參與阿爾茨海默病(AD)、腦缺血性疾病和出血性腦中風發病過程〔12，13〕，這些證據也暗示Cav-1可能與EP有關。 軸突導向因子是近年有關EP發病研究中的一個熱點，正常情況下，在體內低水平表達，主要維持原有軸突和突觸穩定并抑制軸突芽生的作用。Ephrins家族是重要的軸突導向因子，而EphrinA2是Ephrins家族成員之一，廣泛表達在腦組織尤其是海馬中，與EP發作密切相關〔14〕。

相關研究〔15〕發現EphrinA2在顳葉中致癇灶周圍的表達水平明顯高于正常對照組，與本實驗結果一致。Cav-1與EphrinA2關系密切，有研究〔16〕表明缺乏Cav-1導致微血管密度顯著降低，而這種結果與EphrinA2受體的失活有關，提示Cav-1-EphrinA2軸促進血管瘤內皮細胞遷移。提示肉桂醛可通過降低Cav-1的表達導致EphrinA2受體失活，抑制軸突導向因子EphrinA2的表達，穩定突觸，抑制突觸可塑性的激發，從而抑制EP發作。

綜上所述，肉桂醛可通過降低EP大鼠海馬組織Cav-1蛋白和軸突導向因子EphrinA2蛋白的表達，導致EP大鼠潛伏期延長，發作時間明顯縮短，從而降低KA誘導EP大鼠癇性發作，為初步了解肉桂醛抗EP的作用提供一定理論基礎。

4參考文獻

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〔2014-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)