絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟肝細胞核因子－4α表達的影響

絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟肝細胞核因子-4α表達的影響

侯麗娜陳程1劉東慧宋成軍陳志宏

(承德醫學院人體解剖學教研室，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟肝細胞核因子(HNF)-4α表達的影響。 方法雄性SD大鼠48只隨機分為：正常對照組、糖尿病模型組、絲膠治療組和絲膠預防組，每組12只大鼠。鏈脲佐菌素連續腹腔注射制作2型糖尿病大鼠模型，待模型成功建立后，模型組大鼠不做任何處理，絲膠治療組大鼠給予2.4 g·kg-1·d-1的絲膠連續灌胃35 d；絲膠預防組大鼠在鏈脲佐菌素連續腹腔注射前，給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃，時間與絲膠治療組相同。分別采用Western 印跡法和RT-PCR法檢測大鼠肝臟HNF-4α蛋白和mRNA的表達。 結果與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠肝臟HNF-4α蛋白和mRNA的表達明顯升高(P<0.01)；與糖尿病模型組大鼠比較，絲膠治療組、絲膠預防組大鼠肝臟HNF-4α蛋白和mRNA的表達明顯降低(P<0.01)。結論絲膠改善糖代謝的作用可能與其調節肝臟HNF-4α的表達有關。

關鍵詞〔〕絲膠；2型糖尿病；肝臟；肝細胞核因子-4α

中圖分類號〔〕R587〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學

通訊作者：陳志宏(1971-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事糖尿病及其并發癥的中醫藥防治方面的研究。

Effects of sericin on hepatocyte nuclear factor 4 alpha expression in liver of diabetes mellitus rats

HOU Li-Na,CHEN Cheng,LIU Dong-Hui,etal.

Department of Human Anatomy,Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

Abstract【】ObjectiveTo study the effects of sericin on hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF-4α) expression in liver of type 2 diabetes mellitus rats model.Methods48 male SD rats were randomly divided into the following 4 groups:normal control,diabetes model,sericin treatment and sericin prevention groups (n=12).The type 2 diabetes model rats were induced by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin.After successfully establishing the diabetes animal models,the rats in diabetes model group were not given any more treatments.Rats in sericin treatment group were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1).Rats in sericin prevention group were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1) before injecting streptozotocin.Western blot and RT-PCR were used to detect the HNF-4α protein and mRNA expression in liver.ResultsThe HNF-4α protein and mRNA expression in liver of rats in model group were obviously higher than those of normal control group (P<0.01).The HNF-4α protein and mRNA expression in liver of rats in sericin treatment group and sericin prevention group were obviously lower than those of model group (P<0.01).ConclusionsThe effects of sericin on improving glucose metabolism may be associated with its down-regulating the HNF-4α expression in liver.

【Key words】Sericin;Type 2 diabetes mellitus;Liver;Hepatocyte nuclear factor 4 alpha

1天津醫科大學

第一作者：侯麗娜(1986-)，女，碩士，主要從事糖尿病及其并發癥的中醫藥防治方面的研究。

肝細胞核因子(HNF)家族成員，包括肝細胞核因子-4α(HNF-4α)、HNF-1α、HNF-6、HNF-3α和HNF-3β等基因，這些基因的突變與青少年成人發病型糖尿病(MODY)的發生密切相關，其中編碼HNF-4α的基因突變可導致MODY1，主要表現為胰島素分泌缺陷〔1〕。HNF-4α是核受體超家族配基激活型轉錄因子的高度保守成員之一，屬孤受體范疇〔2〕；HNF-4α具有脂溶性激素受體的特性，能夠直接進入胞核發揮調節肝臟、胰島代謝相關基因的表達〔3〕。HNF-4α在肝臟表達水平較高，可通過調節肝糖異生、葡萄糖攝取以及糖酵解等途徑參與血糖調節，有研究表明，2型糖尿病大鼠肝臟HNF-4α的表達水平顯著升高〔4〕。本研究擬觀察絲膠對2型糖尿病模型大鼠肝臟HNF-4α表達的影響及可能機制。

1材料與方法

1.1試劑和藥品絲膠，彩色蠶繭(承德醫學院蠶業研究所)浸泡24 h后水煎2次，過濾并濃縮至所需濃度。鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司，用pH=4.4的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配成2%的溶液，臨用時配制。兔抗HNF-4α多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；Trizol，美國Invitrogen公司；HNF-4α引物，上海生工生物工程有限公司；RT-PCR試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.2動物分組、處理和取材

1.2.1大鼠分組和處理清潔級SD大鼠48只，健康雄性，同批購自河北醫科大學實驗動物中心(712024)，體重200~250 g。大鼠適應性喂養1 w后隨機分為正常對照組、糖尿病模型組、絲膠治療組、絲膠預防組，每組12只。糖尿病模型組、絲膠治療組以25 mg/kg的STZ于大鼠腹腔連續注射3 d制造2型糖尿病動物模型，每天監測各組大鼠血糖，以注射STZ 7 d后大鼠的空腹血糖≥16.7 mmol/L為模型成立。模型成功建立后，模型組大鼠不再做任何處理；絲膠治療組大鼠給予2.4 g·kg-1·d-1的絲膠連續灌胃35 d。絲膠預防組大鼠在同等劑量STZ連續腹腔注射前，給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d。

1.2.2取材各組大鼠分別于用藥結束后以4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經內眥取血，3 000 r/min離心后分離血清，-20℃保存備用。大鼠取血后斷頭處死，迅速取出肝臟，放入液氮中保存備用。

1.3檢測血糖采用葡萄糖氧化酶法檢測各組大鼠的血糖。

1.4大鼠肝臟HNF-4α表達的檢測

1.4.1Western 印跡法檢測HNF-4α蛋白取30 mg液氮保存的肝臟勻漿提取蛋白，二喹林甲酸(BCA)蛋白試劑盒定量蛋白濃度，取50 μg蛋白于8%濃縮膠和12%分離膠電泳后，4℃、2 Ma/cm2轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉過夜，一抗(HNF-4α 1:200，β-actin 1∶1 000)室溫2 h，二抗(1∶5 000)室溫1 h，Super ECL Plus超敏發光液顯影后掃描膠片，采用Quantity One 4.6.2軟件進行定量分析，以HNF-4α條帶與β-actin條帶的灰度比值作為HNF-4α蛋白的相對表達水平。

1.4.2 RT-PCR法檢測HNF-4α mRNA取100 mg液氮保存肝臟組織，提取總RNA。取3 μg總RNA為模板反轉錄成cDNA，反應條件為：42℃孵育3 min；加入反應液Mix，42℃孵育15 min；99℃反應3 min。PCR反應條件：94℃，2 min；94℃，30 s；59℃，30 s；72℃，1 min，第2步起循環。PCR引物序列及擴增條件見表1。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝片，并用Quantity One 4.6.2軟件進行定量分析，以HNF-4α條帶吸光度與β-actin條帶吸光度的比值，作為HNF-4α mRNA的相對表達水平。

表1　PCR引物序列及擴增條件

1.5統計學方法應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2結果

2.1各組大鼠的血糖與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠的血糖水平明顯升高(P<0.01)；與糖尿病模型組比較，絲膠治療組、絲膠預防組大鼠的血糖水平明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠的血糖水平和肝臟HNF-4α的

與糖尿病模型組比較：1)P<0.01

2.2各組大鼠肝臟HNF-4α的表達Western 印跡結果(見圖1)：HNF-4α條帶位于蛋白分子量50 kD水平處，β-actin條帶位于43 kD水平處；RT-PCR結果(見圖2)：HNF-4α mRNA條帶位于300 bp處，β-actin mRNA條帶位于452 bp處。HNF-4α蛋白及mRNA的定量分析結果見表2：與正常對照組相比，糖尿病模型組大鼠HNF-4α蛋白及mRNA的表達明顯升高(P<0.01)，絲膠治療組、絲膠預防組大鼠肝臟HNF-4α蛋白及mRNA的表達較糖尿病模型組明顯降低(P<0.01)。

1.正常對照組；2.糖尿病模型組；3.絲膠治療組；4.絲膠預防組，下圖同 圖1　Western 印跡法檢測大鼠肝臟HNF-4α蛋白的表達

圖2　RT-PCR法檢測大鼠肝臟HNF-4α mRNA的表達

3討論

目前，治療糖尿病多采用一些化學合成的藥物，如二甲雙胍、氯磺丙脲、拜糖平等。據文獻報道，這些藥物在降低血糖的同時具有嚴重的副作用，如氯磺丙脲常見肝損害，雙胍類在降低血糖的同時易引起乳酸性酸中毒，死亡率較高〔5〕。需長期治療的2型糖尿病患者，化學合成藥物嚴重的副作用不利于提高患者生活質量及生存率。因此，尋找一種新的具有良好降糖效果的藥物，更重要的是這種藥物應無毒副作用或毒副作用極少。基于民間有蠶繭泡水輔助降糖的驗方，本課題組的前期研究對絲膠(蠶繭水提物)的降糖作用進行了初步探討，發現絲膠不僅具有良好的降糖效果，并且可調節糖尿病時血脂代謝紊亂，及通過抑制糖尿病時胰島β細胞凋亡保護糖尿病時胰島細胞損傷〔6,7〕。

HNF是調控肝臟基因特異性表達的一類轉錄因子，通過與靶基因調控區順式作用元件的結合調節靶基因的表達〔8〕。HNF-4α在肝臟表達水平較高，參與調控糖脂代謝及胰島素分泌，并與胰島素抵抗有關〔9〕。本研究發現，糖尿病模型大鼠肝臟HNF-4α蛋白和mRNA的表達均明顯升高，與Oyadomari等〔10〕的研究結果相一致。Yoon等〔11〕的研究發現，PGC-1α作為糖異生途徑的關鍵調節因子，在肝臟過度表達可激活糖異生關鍵酶組，但必須依靠與HNF-4α的直接接觸才能發揮作用；另外，HNF-4α可調節肝臟內糖異生途徑中限速酶之一的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因的特異性表達，同時是葡萄糖轉運蛋白2、醛縮酶B、丙酮酸激酶基因表達所必需的〔12,13〕。因此推測，糖尿病模型大鼠肝臟HNF-4α的表達升高可引起肝糖輸出增加，糖酵解速率可能也有所升高，但不能抵消肝糖輸出的增加，從而進一步導致血糖的難以控制〔14〕。

另外，本研究還發現，絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠肝臟HNF-4α蛋白和mRNA的表達，表明絲膠可通過下調糖尿病大鼠肝臟HNF-4α的表達，保護糖尿病時的肝臟損傷。但是絲膠下調糖尿病大鼠肝臟HNF-4α表達的作用，是由絲膠促進胰島素分泌引起的繼發性改變，還是絲膠本身可直接下調HNF-4α的表達，從而調節糖酵解效率和PEPCK等糖代謝過程限速酶的基因表達，最終導致血糖降低的綜合結果，或兩方面雙重調節作用的結果，還有待深入研究。

4參考文獻

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〔2014-03-04修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)