羅格列酮對人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤的影響及機制

羅格列酮對人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤的影響及機制

張萌彭利喬治斌何宏濤周燁徐卓

(河北醫科大學第四醫院肝膽外科，河北石家莊050011)

摘要〔〕目的探討羅格列酮對人肝癌HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤的影響和可能機制。方法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，隨機分為羅格列酮組及對照組。觀察移植瘤生長情況，HE染色觀察移植瘤細胞形態，流式細胞術(FCM)分析細胞周期及凋亡情況，Western印跡法檢測移植瘤細胞中第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(PTEN)、磷酸化蛋白激酶B(pAkt)、S期激酶相關蛋白2(Skp2)及細胞周期蛋白激酶抑制劑P27kip1蛋白的表達情況。結果研究結束時，羅格列酮組移植瘤體積與重量均明顯小于對照組，體積抑制率為52.13%，重量抑制率為65.63%。羅格列酮組移植瘤細胞G0/G1期比例及凋亡率均顯著高于對照組 (P<0.05)。羅格列酮組移植瘤細胞PTEN及P27kip1蛋白的表達量明顯高于對照組，pAkt及Skp2蛋白表達量明顯低于對照組(P<0.05)。結論羅格列酮對人肝癌HepG2細胞裸鼠移植瘤的生長有抑制作用，可引發移植瘤細胞G0/G1期阻滯并誘導其凋亡，其機制可能與羅格列酮上調PTEN蛋白的表達，抑制PI3K/Akt信號通路，下調Skp2蛋白，導致P27kip1蛋白水平升高有關。

關鍵詞〔〕羅格列酮；肝細胞癌；第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因；磷酸化蛋白激酶B；S期激酶相關蛋白2；細胞周期蛋白激酶抑制劑P27kip1

中圖分類號〔〕R735.7；R73-361〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省高校強勢特色學科資助項目(2005-52)；河北省衛生廳資助課題(06142)

通訊作者：彭利(1972-)，男，博士，教授，主任醫師，主要從事肝膽腫瘤研究。

第一作者：張萌(1977-)，男，博士，副主任醫師，主要從事肝膽腫瘤的研究。

最近研究在體外實驗中發現噻唑啉二酮類(TZDs)藥物可通過激活PPAR-γ發揮抑制腫瘤增殖、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等作用〔1〕。而其對肝癌細胞裸鼠移植瘤是否具有類似作用及相關機制的體內研究則未見報道。本實驗通過構建人肝癌HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察TZDs典型藥物羅格列酮對移植瘤生長及細胞周期和凋亡的影響，檢測PTEN、pAkt、Skp2及P27kip1蛋白表達的變化，探討羅格列酮對裸鼠皮下移植瘤生長的作用及可能機制。

1材料與方法

1.1 主要材料與試劑人肝癌細胞系HepG2由河北醫科大學第四醫院科研中心提供。BALB/c-nu/nu裸小鼠，共10只，4周齡，雄性，體重18~22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(動物許可證編號：SCXK京2009-0007)。于河北醫科大學第四醫院實驗動物中心〔動物實驗室合格證號：(SYXK(冀)2008-0051〕，SPF級層流柜內分籠飼養。羅格列酮(商品名：文迪雅)購自葛蘭素史克(天津)有限公司。PTEN兔抗人單克隆抗體、pAkt(pS473)兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司，Skp2 p45(H-435)兔抗人多克隆抗體、P27kip1(F-8)鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 人肝癌細胞系HepG2細胞的制備及荷瘤裸鼠動物模型的建立用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基在5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養人肝癌HepG2細胞。取對數生長期的單層培養細胞，用0.25%胰酶對單層細胞進行消化，充分吹打后，無血清RPMI-1640培養基洗滌2次，1 500 r/min，離心5 min，重懸于生理鹽水中，調整細胞濃度為2×1010/L，用1 ml空針以每只0.2 ml(4×106個細胞)于裸小鼠左側肩胛部皮下注射建立移植瘤模型。

1.3 實驗分組及藥物干預待移植瘤生長至約100 mm3時，將10只裸鼠隨機分為羅格列酮組和對照組(每組5只)。羅格列酮組給予30 mg/kg羅格列酮(生理鹽水溶解)每天1次灌胃，對照組給予相應體積生理鹽水每天1次灌胃。

1.4 裸鼠體內成瘤觀察實驗過程中每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，按公式計算裸鼠移植瘤體積：V=a×b2/2，并計算相對移植瘤體積(RTV)，RTV=Vt/ V0。V0為分組給藥時測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。實驗結束后采用斷頸法統一處死裸鼠，剝離腫瘤，稱重，計算腫瘤生長抑制率，體積抑制率(%)=(對照組平均瘤體積-羅格列酮組平均瘤體積)/對照組平均瘤體積×100%。重量抑制率(%)=(對照組平均瘤重-羅格列酮組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.5 移植瘤組織HE染色移植瘤標本經10%甲醛固定、浸蠟、包埋后，常規病理切片，行HE染色，光鏡觀察。

1.6 FCM檢測細胞凋亡和細胞周期網搓法制備單細胞懸液，PBS洗滌樣品，調整每份樣品的細胞數為1×106/ml，PI染色，經流式細胞儀，應用Muticycle AV軟件對凋亡及細胞周期進行分析。在二倍體細胞峰前出現一個亞二倍體峰判定為凋亡細胞峰，以凋亡率表示凋亡狀態。依據DNA細胞周期擬合分析所得組方圖，計算出各時相分布的百分比。

1.7 Western印跡法檢測PTEN、pAkt、Skp2及P27kip1蛋白表達冰浴下各移植瘤組織塊與細胞裂解液在勻漿器中反復研磨(每100 mg組織加400 μl RIPA裂解液)，提取總蛋白。蛋白定量采用考馬斯亮藍方法，根據考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒說明書進行。

1.8 統計學方法采用SPSS17.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2結果

圖1　羅格列酮對肝癌HepG2細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用

2.1 羅格列酮對肝癌HepG2細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用接種人肝癌HepG2細胞后，裸鼠皮下注射處2 d后局部水腫消失，5 d后全部成瘤，成瘤率達100%。移植瘤呈圓形或結節形。初期瘤體表面光滑，隨著瘤體逐漸增大，藥物干預5 w后發現部分裸鼠瘤體表面潰破、結痂。為避免混雜性偏倚，在連續給藥5 w、即觀察時間共計6 w時終止實驗。荷瘤裸鼠生長狀態良好，飲食及活動正常，無其他明顯不良反應。羅格列酮組的裸鼠RTV低于對照組(P<0.05)(圖1、圖2)。實驗結束時羅格列酮對裸鼠移植瘤的最大體積抑制率為52.13%，重量抑制率為65.63%。見表1。

與羅格列酮組比較：1)P<0.05 圖2　移植瘤生長曲線

組別RTV(Vt/V0)移植瘤重量(g)抑制率(%)體積重量對照組14.82±5.723.55±1.31--羅格列酮組8.02±1.521)1.22±0.551)52.1365.63

與對照組比較:1)P<0.05；下表同

2.2 裸鼠移植瘤的光鏡形態學觀察羅格列酮組及對照組移植瘤鏡下觀察未見明顯區別：移植瘤細胞異型性明顯，瘤組織少量壞死，局限于中央區域。瘤細胞之間排列緊密，大小不一，形態不規則。細胞核染色質呈粗顆粒狀，核仁較大，清晰，偶見瘤巨細胞，核分裂像多見。見圖3。

圖3　不同組別裸鼠移植瘤光鏡下形態觀察(HE，×400)

2.3 羅格列酮對裸鼠移植瘤細胞周期和凋亡的影響流式細胞術檢測顯示，羅格列酮組移植瘤細胞凋亡率高于對照組，羅格列酮組移植瘤G0/G1期細胞比例顯著增高，S期細胞比例明顯降低(P<0.05)，而G2/M期細胞比例無明顯變化。見表2。

表2　羅格列酮對移植瘤細胞凋亡和

2.4 裸鼠移植瘤PTEN、pAkt、Skp2及P27kip1蛋白的表達羅格列酮組裸鼠移植瘤組織中pAkt和Skp2蛋白表達量均低于對照組，PTEN和P27kip1蛋白表達量高于對照組(P<0.05) 。見圖4、表3。

圖4　不同組別裸鼠移植瘤中PTEN,pAkt,Skp2 和P27 kip1 蛋白的表達(Western blot)

組別PTEN蛋白pAkt蛋白Skp2蛋白P27kip1蛋白對照組0.20±0.141.55±0.241.49±0.280.39±0.11羅格列酮組0.47±0.221)0.83±0.201)0.65±0.161)0.96±0.251)

與對照組比較：1)P<0.05

3討論

近年來，PPAR-γ配體的抗腫瘤作用受到越來越多的重視，此類作用與PPAR-γ激活后參與調控多條信號通路有密切關系，但具體的作用機制并不清楚〔2〕。PPAR-γ的合成配體以噻唑烷二酮類藥物為主要代表，其中羅格列酮對PPAR-γ的親和力最大，特異性最強。已有研究證實，羅格列酮可抑制人肝癌MHCC97L、BEL-7404細胞的增殖并誘導其凋亡〔3〕。

前期研究已經證實，PPAR-γ蛋白在人肝細胞癌組織中表達升高，且與腫瘤的惡性生物學行為有一定關系〔4〕，其激動劑羅格列酮可在體外抑制人肝癌細胞的增殖，誘導肝癌細胞凋亡，并使其發生G0/G1期阻滯〔5〕。為了進一步研究羅格列酮的體內抑瘤作用，本實驗采用肝癌細胞株移植瘤的方法，于裸鼠皮下接種一定數量的HepG2細胞，成功構建了肝癌荷瘤裸鼠模型。根據文獻采用每天1次灌胃法，觀察裸鼠移植瘤的變化〔6〕，提示羅格列酮對人肝癌細胞HepG2的裸鼠移植瘤有明顯的生長抑制作用。且可誘導人肝癌細胞HepG2的裸鼠移植瘤細胞凋亡，并導致細胞周期發生G0/G1期阻滯，推測這可能是羅格列酮抑制裸鼠移植瘤生長的內在機制。但是光鏡下觀察并未發現兩組存在明顯差別，我們認為這符合實體瘤的鏡下表現。

Jagan等〔7〕的研究發現，羅格列酮可以上調人結腸癌Caco-2細胞中PTEN的表達，且可被PPAR-γ抑制劑GW9662逆轉，證實羅格列酮的該效應是通過激活PPAR-γ實現的。PTEN是迄今發現的唯一具有脂質磷酸酶與蛋白磷酸酶兩種活性的抑癌基因，在誘導細胞周期阻滯、促進細胞凋亡以及遷移、分化等諸方面均起重要的作用〔8〕。脂質磷酸酶活性是PTEN抑制腫瘤的主要功能基礎，PTEN可通過該活性降解PI3K活化產生的信使PIP3，使其去磷酸化為PIP2，失去對Akt的激活，維持pAkt的低水平，從而抑制PI3K/Akt通路〔9〕。PI3K/Akt信號通路在廣泛的人類腫瘤中表達失調，是十分重要的凋亡抑制通路，而作為該通路效應核心的pAkt可以通過多種機制激活Skp2〔10〕。Skp2的激活將加速降解細胞周期抑制蛋白P27kip1，使細胞周期調節失控，導致癌變的發生〔11〕。本實驗結果與上述學者的研究結論基本一致，提示羅格列酮促使移植瘤細胞發生G0/G1期阻滯、誘導細胞凋亡的作用機制可能與其上調PTEN的表達水平，抑制PI3K/Akt信號通路，下調Skp2蛋白的表達，最終導致P27kip1蛋白水平升高有關。

另有學者研究發現，PPAR-γ配體可以通過其他信號通路發揮抗腫瘤作用。Shim等〔12〕研究發現吡格列酮及15d-PGJ2可抑制乙型肝炎相關性肝癌細胞的增殖，促進其凋亡，此作用是通過上調腫瘤細胞中凋亡促進蛋白Bax及Bad的表達，降低凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達實現的。Bren-Mattison等〔13〕發現PPAR-γ配體可通過抑制非小細胞肺癌細胞中核因子NF-κB的活性，降低環氧合酶-2的表達，誘導細胞凋亡。因此，有關PPAR-γ配體抗腫瘤作用的分子機制及所產生的網絡交互作用仍需進行深入研究。

4參考文獻

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13Bren-Mattison Y,Meyer AM,Van Putten V,etal. Antitumorigenic effects of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in non-small-cell lung cancer cells are mediated by suppression of cyclooxygenase-2 via inhibition of nuclear factor-kappaB〔J〕.Mol Pharmacol,2008;73(3):709-17.

〔2013-12-20修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)