燈盞乙素對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側腦組織熱休克蛋白70表達的影響

燈盞乙素對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側腦組織熱休克蛋白70表達的影響

王龍梓

(淄博職業學院藥學系，山東淄博255314)

摘要〔〕目的觀察燈盞乙素對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側腦組織熱休克蛋白(HSP)70表達的影響。方法采用大腦中動脈栓線阻斷法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，免疫組化和RT-PCR檢測燈盞乙素對大鼠缺血損傷腦組織HSP70蛋白和mRNA表達的影響。結果燈盞乙素可明顯增強缺血再灌注損傷大鼠缺血側腦組織HSP70蛋白和mRNA的表達。結論燈盞乙素可明顯增強大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷腦組織HSP的表達，這可能與其腦保護作用有關。

關鍵詞〔〕燈盞乙素；腦缺血；熱休克蛋白(HSP)70；HSP70 mRNA

中圖分類號〔〕R749〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：王龍梓(1976-)，男，碩士，講師，主要從事心腦血管藥理學研究。

燈盞花素是從燈盞細辛中提取的黃酮類成分，燈盞乙素為燈盞花素的主要藥效成分。燈盞乙素和燈盞花素的腦保護作用機制復雜，至今尚不清楚。熱休克蛋白(HSP)70為急性腦損傷后腦組織表達的一種應激保護蛋白，可抑制神經細胞凋亡和死亡，維持神經細胞功能，具有多種腦保護作用。劉萍等〔1〕發現腦保護藥黃芩苷可使局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織海馬部位HSP70表達明顯增加。燈盞乙素又名野黃芩苷，與黃芩苷結構相似(黃芩苷4′位引入一個羥基即為燈盞乙素，見圖1)，但其治療用藥對腦缺血后HSP70表達的影響未見文獻報道。本研究擬應用大腦中動脈栓線阻斷法構建大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，檢測燈盞乙素治療給藥對缺血腦組織HSP70蛋白和mRNA表達的影響。

1材料與方法

1.1藥品與試劑燈盞乙素，云南玉溪萬方天然藥物有限公司，批號：020509；尼莫地平，山東健康藥業有限公司，批號：0401402-H；多聚甲醛：浙江菱湖振興助劑廠，批號：960508。兔抗大鼠HSP70多克隆抗體：美國Newmark公司產品，福州邁新生物技術開發有限公司提供。即用型第二代免疫組化ElivisionTMplus試劑盒(Kit-9901)、DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術開發有限公司。Trizol：上海生工生物工程技術服務有限公司產品。

圖1　燈盞乙素與黃芩苷分子式

1.2儀器C-5050ZOOM數碼照相機：日本OLYMPUS公司。醫學形態學圖像分析系統：江蘇捷達科技發展有限公司。MiniCyclerTM 擴增儀：美國PERKIN ELMER(PE)公司。DY-600 中壓電泳儀：美國BECTON DICKINSON(BD)公司。

1.3動物分組與模型制備Wistar大鼠，健康雄性，體重270~300 g，山東大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(魯)20030004。隨機分為6組：即假手術組，缺血再灌注損傷組(IR組)，尼莫地平組(尼莫地平0.4 mg·kg)，燈盞乙素低、中、高劑量組(燈盞乙素12.5 、25 和50 mg/kg)。實驗動物經水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，采用大腦中動脈內栓線阻斷法(CAO)制備大鼠左側大腦中動脈阻塞模型，1 h后拔線實現再灌注。按上述劑量分別于缺血后和再灌注后立即靜脈給藥1次(每次給半量)。

1.4逆轉錄聚合酶鏈反應檢測HSP70 mRNA的表達腦缺血1 h再灌注24 h后處死大鼠，取大鼠缺血側海馬區腦組織50 mg，應用Trizol法進行組織總RNA的提取，冰上逆轉錄合成cDNA，然后進行PCR擴增反應。以β-actin為內參照，引物參照文獻〔2〕，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。以目的基因和內參照(β-actin)基因譜帶的積分光密度比值表示目的基因的相對表達水平。

1.5免疫組織化學法檢測HSP70蛋白表達大鼠腦缺血1 h再灌注24 h麻醉后仰臥固定，快速剪開腹腔和胸腔前壁，清晰暴露出心臟和升主動脈，用連有輸液管的預處理為鈍圓的針頭由心尖處插入左心室，并通過心腔插入升主動脈，應用4℃ pH=7.4的4%多聚甲醛進行快速全身灌流固定。灌流結束后斷頭取腦，常規梯度脫水，透明，石蠟包埋。取缺血側背側海馬常規4 μm連續冠狀切片。切片進行HSP70蛋白免疫組織化學檢測。以Elivision兩步法染色，參照試劑盒說明書進行。胞質或胞核內有棕黃色顆粒者為陽性細胞。利用醫學形態學圖像分析系統測定海馬CA1區陽性染色的平均光密度與陽性細胞數，并計算大鼠神經細胞陽性表達指數(PEI)：PEI=平均光密度×陽性細胞百分率。

1.6統計學處理采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1燈盞乙素對大鼠缺血側腦組織HSP70 mRNA表達的影響假手術組HSP70 mRNA表達弱(0.27±0.03)，IR組HSP70 mRNA表達明顯增加(0.71±0.13，P<0.001)；低、中、高劑量燈盞乙素組和尼莫地平組HSP70 mRNA表達進一步升高，均明顯高于IR組(0.90±0.03、0.98±0.05、0.95±0.07、0.81±0.97，P<0.001)。見圖2。

2.2燈盞乙素對大鼠缺血側腦組織HSP70蛋白表達的影響假手術組棕黃色HSP70蛋白表達陽性細胞少見，且胞質著色淡(PEI為3.87%±2.51%)。IR組缺血側腦組織可見棕黃色HSP70蛋白表達陽性細胞，主要分布于皮層、海馬及紋狀體等區域，其中海馬區表達最強(PEI為19.14%±3.14%)。低、中、高劑量燈盞乙素組及尼莫地平組棕黃色HSP70蛋白表達進一步增強，海馬區陽性細胞密集分布，且陽性細胞質著色深(PEI分別為31.90%±7.03%、37.97%±4.65%、50.40%±4.94%、30.76%±4.31%)。各用藥組HSP70蛋白表達在模型組基礎上進一步明顯升高(P<0.001)。見圖3。

1：假手術組，2：IR組，3：燈盞乙素低劑量組，4：燈盞乙素中劑量組，5：燈盞乙素高劑量組，6：尼莫地平組 圖2　燈盞乙素對大鼠腦缺血側海馬CA1區 HSP70 mRNA表達的影響

圖3　免疫組織化學法檢測大鼠腦缺血側海馬CA1區HSP70蛋白的表達(DAB，×400)

3討論

HSP被稱為分子伴侶，參與蛋白質的正常折疊，使其成為功能蛋白質。HSP中以熱休克蛋白70(HSP70)進化最為保守，在大多數生物中含量高。正常情況下HSP70 mRNA在細胞內穩定表達，但很快降解，故HSP70 mRNA在正常細胞表達水平低，HSP70合成較少。腦缺血可誘導HSP70 mRNA的表達，組織學檢查顯示預缺血能夠顯著減少大鼠全腦缺血模型腦缺血敏感區海馬CA1區神經元死亡數量。研究顯示， 預缺血誘導海馬CA1區神經元內蛋白伴侶HSP70 在再灌注后24 h表達，提示預缺血可能通過誘導蛋白伴侶HSP70的表達減少再缺血引起的神經元死亡〔3〕。為了使外源性的HSP70發揮作用，有人將HSP70與分子轉運體重組，制備Fv-HSP70，用于腦缺血再灌注損傷SD大鼠，具有明顯腦保護作用〔4〕。

HSP70的腦保護作用機制主要是其分子伴侶作用，多基于HSP70基因敲除，通過基因轉導或熱應激制備的基因過表達模型。HSP70可通過抑制氧自由基，抑制細胞凋亡等機制產生腦保護作用，HSP70也調節炎癥通路。研究顯示，幾種藥物能抑制HSP90，誘導HSP70的表達，影響神經系統炎癥反應來保護腦率中和腦損傷〔5〕。

多種化學藥物可促進腦缺血損傷后HSP70的表達。抗癲癇藥丙戊酸具有神經保護作用。有學者制備大鼠短暫性全腦缺血再灌注損傷模型，給予丙戊酸治療，全腦缺血再灌注7 h后指標檢測發現，丙戊酸可明顯改善大鼠認知功能缺損，明顯增加大鼠全腦缺血再灌注后大腦海馬CA1區神經元密度，而誘導大鼠大腦海馬組織HSP70表達是上述腦保護作用的重要機制〔6〕。去卵巢大鼠慢性腦組織灌注不足14 d，缺血敏感區海馬組織神經細胞數量減少，丙二醛(MDA)增加，HSP70表達增加，超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)活性降低。而褪黑素應用后，與缺血模型組相比，SOD，GSH活性水平恢復，誘導HSP70表達增加，提示褪黑素可有助于血管性癡呆和腦灌注不足的治療〔7〕。

關于植物藥活性成分促進HSP70表達的研究不少學者關注黃芩苷。將沙鼠雙側頸動脈阻斷5 min，阻斷時立即腹腔注射黃芩苷200 mg/kg，再灌注7 d后，結果顯示黃芩苷明顯改善神經功能缺損，明顯增加增加海馬部位HSP70表達，提示黃芩苷可通過增加HSP70的表達對沙鼠全腦缺血產生保護作用〔8〕。劉萍等〔1〕將黃芩苷用于局灶性腦缺血1 h,再灌注24 h大鼠，發現腦組織海馬部位HSP70表達明顯增加。但黃芩苷劑量需用至100 mg/kg，腦組織海馬部位HSP70表達方明顯強于模型組。本研究提示燈盞乙素促進缺血腦組織作用HSP70表達的作用可能強于黃芩苷。所以本研究認為，需要進一步深入研究HSP70表達保護腦缺血損傷的機制，進一步研究燈盞乙素等天然藥物促進腦缺血再灌注損傷后HSP70表達強度不同的原因，從而為找到理想的腦缺血損傷保護藥提供思路。

4參考文獻

1劉萍，王菊英，李倩,等.黃芩苷對大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬神經元HSP70表達的影響〔J〕.藥學學報，2006;41(7)：619-24.

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6Xuan A，Long D，Li J，etal.Neuroprotective effects of valproic acid following transient global ischemia in rats〔J〕.Life Sci，2012;90(11-12):463-8.

7Ozacmak VH，Barut F，Ozacmak HS.Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats〔J〕.J Pineal Res，2009;47(2)：156-63.

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〔2013-11-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)