卵磷脂膽固醇酰基轉移酶基因多態性與腦出血的關系

卵磷脂膽固醇酰基轉移酶基因多態性與腦出血的關系

戴繽李海燕1胡志強黃輝朱廣通孟國路2萬偉慶2

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院神經外科，北京100050)

摘要〔〕目的探討卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)基因511C/T多態性與漢族人群腦出血的關系。方法選擇2012年6月至2013年10月該院收治的原發性腦出血患者102例，健康對照120例。采用聚合酶鏈式反應(PCR)、單鏈構象多態性(SSCP)和DNA測序法檢測LCAT 511C/T基因多態性。采用氧化酶法檢測受試者血脂水平。結果腦出血組CT基因型頻率為6.87%，對照組為1.67%，腦出血組T等位基因頻率為3.43%，對照組為0.83%，組間差異均無統計學意義(P>0.05)。511CC組總膽固醇(TC)水平明顯低于511CT組，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平升高(t=2.524，P=0.013；t=1.871，P=0.049)。在腦出血組中，511CC組HDL-C水平明顯高于511CT亞組(t=1.954，P=0.047)。結論LCAT基因511C/T多態性與腦出血無關，而T等位基因與HDL-C代謝有關。

關鍵詞〔〕卵磷脂膽固醇酰基轉移酶；腦出血；基因多態性；高密度脂蛋白膽固醇

中圖分類號〔〕R743〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院院級青年基金(2010-Q06)

1首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院神經內科

2首都醫科大學附屬天壇醫院神經外科

第一作者：戴繽(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事神經外科疾病診治研究。

血脂代謝異常尤其是高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低，導致膽固醇在動脈壁沉積、血管粥樣硬化，是腦出血的重要致病因素〔1，2〕。卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)是HDL-C代謝的關鍵酶，遺傳性LCAT缺陷癥、LCAT基因突變均會影響LCAT的表達、分泌及代謝，進而影響機體HDL-C水平〔3〕。LCAT是動脈粥樣硬化(AS)的易感基因之一〔4〕，在動物模型中能誘發冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死、腦出血等AS相關疾病〔5〕，但目前LCAT多態性與心血管事件發生的相關性仍存在爭議〔6〕。本研究通過對腦出血患者進行LCAT基因511C/T多態性檢測，探究LCAT基因多態性與腦出血的關系。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年6月至2013年10月我院收治的腦出血患者102例，男67例，女35例，平均年齡(61.7±1.9)歲，體重指數(BMI)(23.5±1.2)kg/m2；既往吸煙史26例，飲酒史18例，高血壓史102例，糖尿病史6例。所有患者經MRI或CT確診，排除心源性栓塞、梗死后出血、腫瘤、血液病、腦血管畸形、動脈瘤、淀粉樣腦血管病、藥物引起的腦卒中、冠心病患者以及入組前3個月曾服用影響血脂水平藥物的患者。選取同期于我院接受體檢的健康對照組120例，男74例，女46例，平均年齡(60.1±1.5)，BMI(24.3±1.9)kg/m2;既往吸煙史19例，飲酒史12例，高血壓史17例，糖尿病史5例。兩組性別、年齡、BMI、生活方式、糖尿病等方面差異無統計學意義(P>0.05)，但腦出血組患者伴有高血壓的比例顯著高于對照組(P=0.002)。所有研究對象均為漢族。研究經醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2血脂測定取受試者靜脈血10 ml，5 ml用于血脂測定，5 ml用于DNA制備(加枸櫞酸鈉抗凝)。所有受試者取血前均常規禁食12 h。

采用氧化酶法測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、HDL-C水平，計算低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，公式為LDL=TC-(HDL-C)-(TG/5)。采用免疫比濁法測定載脂蛋白(apo)A-I及apoB100。

1.3DNA制備采用常規酚/氯仿抽提法提取DNA。將靜脈血置于離心管(50 ml)中，加25 ml的1倍紅細胞裂解緩沖液，混勻后置于4℃冰箱30 min。液體透明后離心10 min(3 000 r/min)，留管底白細胞層。依次加入3 ml核裂解液，150 μl 20%SDS溶液以及20 μl 20 mg/ml蛋白酶K溶液，充分混勻后于37℃恒溫搖床過夜。次日加入3 ml飽和重蒸酚，充分搖勻10 min，離心10 min(3 000 r/min)，取上清液至無菌15 ml離心管中。加入30 ml無水乙醇，倒轉混勻后可見白色絮狀物析出。取干凈玻璃鉤經火焰滅菌冷卻后鉤出上述白色絮狀物，70%乙醇沖洗2次，室溫下干燥2~3 min，置于500 μl的1倍TE中溶解，室溫放置過夜后-70℃冰箱保存。

1.4聚合酶鏈反應(PCR)引物根據基因組序列(NT10478)用Primer3軟件設計，且用GCG軟件行BLAST對比。引物序列：正義5′-GTACCTGGACAGCAGCAA-3′，反義5′-GTAGGCGTCTCTGTGAGTA-3′。選用PE4800型PCR反應儀進行擴增：95℃預變性3 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環，最后72℃充分延伸5 min。采用凝膠電泳分析PCR產物特異性。

1.5單鏈構象多態性分析(SSCP)取5 μl特異性好的PCR產物，加入5 μl的2倍變性緩沖液，混勻后99℃變性10 min，置于冰上5 min，將變性產物迅速上樣至含5%甘油的80 g/L丙烯酰胺凝膠(49∶1)，恒溫電泳后銀染。

1.6DNA序列分析選取有異常條帶的LCAT基因511C/T陽性標本進行DNA正向測序，將測序結果與GenBank和SNP數據庫比較分析，測序由上海英駿公司完成。

1.7統計學分析采用SPSS17.0軟件。基因型的Hardy-Weinberg平衡(HWE)吻合度采用HWE軟件進行分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。計量資料組間比較采用t檢驗。

2結果

2.1基因型分布經Hardy-Weinberg檢驗，對照組LCAT基因511C/T位點基因型符合HWE(P>0.05)，樣本具有群體代表性。腦出血組與對照組CT基因型頻率差異無統計學意義(χ2=0.240，P=0.620)，兩組T等位基因頻率也無統計學差異(χ2=2.529，P=0.117)。見表1。

2.2不同基因型亞組間血脂水平比較511CC組TC水平明顯低于511CT組(t=2.524，P=0.013)，HDL-C水平明顯高于511CT組(t=1.871，P=0.049)，其他血脂水平兩組間無統計學差異(P>0.05)。腦出血組511CC亞組HDL-C水平明顯高于511CT亞組(t=1.954，P=0.047)，而其他血脂水平兩組間無統計學差異(P>0.05)，見表2 。因對照組CT基因組樣本例數過少，未做511C/T多態性與血脂水平關系的統計學分析。

表1　兩組LCAT基因511C/T基因頻率和

表2　511CC型和511CT型亞組間血脂水平比較

3討論

遺傳因素在腦出血發生中起重要作用，易感基因除直接誘發腦出血，還通過影響動脈粥樣硬化而間接發揮作用，成為腦出血遺傳機制研究的熱點。LCAT作為HDL-C代謝的關鍵酶，能夠水解血漿中氧化的LDL，抑制巨噬細胞對LDL的吞噬作用，防止其生成泡沫細胞，拮抗AS形成過程〔7〕。Holleboom等〔8〕檢測低HDL-C的病人LCAT位點發現29%的病人攜帶有突變位點，而Pan等〔9〕對亞洲人群的研究也發現LCAT位點突變與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和血脂紊亂有關。

本研究結果提示，LCAT基因511C/T多態性可能與我國漢族人群腦出血無關。朱曉巖等〔10〕對我國漢族人群LCAT多態性與家族聚集性腦出血的關系研究結果顯示，LCAT基因608C/T、511C/T多態性與我國漢族人群腦出血發病無關，但與動脈粥樣硬化性腦梗死有關。這與我們的研究結果相符，可能的原因：①原發性腦出血的主要病因為高血壓〔11，12〕，動脈粥樣硬化雖在腦出血中起重要作用，但仍受其他相關因素影響；②LCAT基因突變率相對較低；③LCAT約有10個功能性位點突變，511C/T位點突變可能與其他位點存在連鎖關系，需多位點聯合分析其作用。LCAT基因型亞組與血脂水平關系分析結果顯示，LCAT與HDL-C代謝水平有關，而HDL-C能夠將巨噬細胞內的膽固醇轉運到肝臟，并通過代謝排出體外，降低膽固醇水平，因而LCAT可能間接影響TC水平。Agirbasli等〔13〕在土耳其進行的大規模人群LCAT基因多態性與血脂水平關系分析結果顯示，LCAT多位點突變均與TC、HDL-C水平密切相關，且以4886C/T位點突變最常見。Naseri等〔14〕對歐洲人群的研究也發現LCAT基因多態性與HDL-C水平有關，這與我們的研究結果一致。但LCAT不同位點突變對TC、HDL-C水平影響不同，因而511C/T位點突變需結合其他位點進行多位點綜合分析。總之，本研究結果顯示LCAT基因多態性與腦出血發生率無關，但與HDL-C水平密切相關，提示LCAT基因多態性是HDL-C代謝的重要生物學指標。

4參考文獻

1王浩然，于春江.動脈粥樣硬化發生機制及治療藥物的研究進展〔J〕.首都醫科大學學報，2010；31(6)：828-33.

2Wang X，Dong Y，Qi X，etal.Cholesterol levels and risk of hemorrhagic stroke a systematic review and meta-analysis〔J〕.Stroke，2013；44(7)：1833-9.

4Savel J，Lafitte M，Pucheu Y，etal.Very low levels of HDL cholesterol and atherosclerosis，a variable relationship-a review of LCAT deficiency〔J〕.Vasc Health Risk Manag，2012；8：357.

5Toledo-Ibelles P，García-Sánchez C，vila-Vazzini N，etal.Enzymatic assessment of cholesterol on electrophoresis gels for estimating HDL size distribution and plasma concentrations of HDL subclasses〔J〕.J Lipid Res，2010；51(6)：1610-7.

6王曉黎，曹艷麗，張錦，等.遺傳性LCAT缺陷癥與動脈粥樣硬化〔J〕.中國微生態學雜志，2012；24(5)：472-5.

7Barbara AH，Schimmel W，Kastelein JJP，etal.Carriers of lecithin：cholesterol acyltransferase gene mutations have accelerated atherogenesis as assessed by carotid 3.0-T magnetic resonance imaging〔J〕.J Am Coll Cardiol，2011;58(24)：2481-7.

8Holleboom AG，Kuivenhoven JA，Peelman F，etal.High prevalence of mutations in LCAT in patients with low HDL cholesterol levels in The Netherlands：identification and characterization of eight novel mutations〔J〕.Human Mutation，2011；32(11)：1290-8.

9Pan JP，Wei SLP，Chiang SC，etal.Association of apolipoprotein J polymorphism 1598delT with coronary artery disease and lipoprotein levels〔J〕.Cardiology，2011；118(2)：83-92.

10朱曉巖，許宏偉，侯榮耀，等.卵磷脂膽固醇酰基轉移酶基因608C/T多態性與動脈粥樣硬化性腦梗塞的關聯研究〔J〕.中華醫學遺傳學雜志，2006；4：419-22.

11蔣小群，郝子龍，王秋筱，等.腦出血患者出血部位與病因構成的相關性研究〔J〕.中國腦血管病雜志，2013；10(5)：259-63.

12McKinney JS，Kostis WJ.Statin therapy and the risk of intracerebral hemorrhage a meta-analysis of 31 randomized controlled trials〔J〕.Stroke，2012；43(8)：2149-56.

13Agirbasli D，Cirakoglu B，Eren F，etal.Effects of lecithin：cholesterol acyltransferase genotypes，enzyme levels，and activity on high-density lipoprotein levels〔J〕.J Clin Lipidol，2011；5(3)：152-8.

14Naseri M，Hedayati M，Daneshpour MS，etal.Identification of genetic variants of lecithin cholesterol acyltransferase in individuals with high HDL C levels〔J〕.Mol Med Rep，2014；10(1)：496-502.

〔2014-01-17修回〕

(編輯徐杰)