小薊葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖條件優(yōu)化

摘要[目的]建立小薊愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)體系。[方法]以野生小薊無菌苗葉片為外植體，分析2，4D、6BA、NAA對小薊愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖的影響，確定最適宜的激素組合。[結(jié)果]單因素條件下，0.8 mg/L 2，4D、0.9 mg/L 6BA、2.0 mg/L NAA為小薊葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳濃度；MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L培養(yǎng)基為小薊葉片愈傷組織最適誘導(dǎo)組合。單因素條件下，2，4D、NAA不適合小薊愈傷組織增殖培養(yǎng)，MS+6BA 0.3 mg/L為小薊葉片愈傷最佳增殖培養(yǎng)基。[結(jié)論]該研究為小薊的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞小薊；葉片；愈傷組織誘導(dǎo)；愈傷組織增殖；優(yōu)化

中圖分類號S567.23+9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）26-067-03

Abstract[Objective] The research aimed to establish the systems of callus induction and proliferation of Cirsium setosum.[Method]With leaves aseptic Cirsium setosum seedlings as explants， the effect of 2，4D，6BA and NAA on callus induction and proliferation of Cirsium setosum were researched. The optimum combination of hormones was determined.[Result]Under ingle factor design， the callus induction were better inducted in MS medium with 0.8 mg/L 2，4D，0.9 mg/L 6BA and 2.0 mg/L NAA. The optimum medium for the callus induction was MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L. The optimum medium for the callus proliferation was MS+6BA 0.3 mg/L. 2，4D and NAA were not suitable for callus proliferation.[Conclusion] The study provides a foundation for further development and utilization of Cirsium setosum.

Key wordsCirsium setosum；Leaf；Callus induction；Callus proliferation；Optimization

小薊（Cirsium setosum），又稱刺兒菜、萋萋菜、刺角芽等，為菊科薊屬多年生草本植物[1]，是一種常用的本草中藥材，有很好的止血、凝血和抗炎功效[2-3]，其提取物對腫瘤細(xì)胞活性有抑制作用，同時小薊還是一種營養(yǎng)豐富的蔬菜[4]。但小薊多以野生狀態(tài)為主，其有效成分的形成機制、利用以及開發(fā)受到了限制。建立一套穩(wěn)定的小薊組織培養(yǎng)體系，是小薊深入研究的基礎(chǔ)。該試驗以小薊無菌苗葉片為供試材料，確立小薊最佳的愈傷組織誘導(dǎo)及增殖條件，為小薊的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

野生小薊種子采自華北理工大學(xué)校園。

1.2方法

1.2.1無菌苗培養(yǎng)。

小薊種子用1.0%升汞溶液浸泡10～20 min，無菌水沖洗3～4次，再用75%酒精浸泡10～20 s，無菌水沖洗4～5次，然后接種于MS培養(yǎng)基（10 g/L蔗糖、4 g/L瓊脂、pH 5.0～6.0）[5-6]。

1.2.2培養(yǎng)條件。

無菌苗培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)及增殖均在光照培養(yǎng)箱中。采用光周期12 h/d、光強6 000 lx、溫度25 ℃的培養(yǎng)條件。選擇MS+30 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂（pH 6.0）作為愈傷誘導(dǎo)及增殖的基本培養(yǎng)基。

1.2.3植物調(diào)節(jié)劑對小薊葉片愈傷組織誘導(dǎo)。

單因素條件下，確定2，4D（0、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/L）、6BA（0、0.4、0.7、0.9、1.1、1.5 mg/L ）、NAA（0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L）對小薊愈傷組織誘導(dǎo)影響；采用L9（34）正交設(shè)計，設(shè)置2，4D（0.6、0.8、1.0 mg/L）、6BA（0.7、0.9、1.1 mg/L）和NAA（1.5、2.0、2.5 mg/L）三因素三水平試驗[7]，篩選最適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件。

選擇長勢良好的無菌苗葉片，剪成約5 mm×5 mm大小接種于不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，觀察愈傷組織的生長狀態(tài)，培養(yǎng)21 d后，統(tǒng)計愈傷組織重量誘導(dǎo)系數(shù)（愈傷組織重量/外植體接種重量）和誘導(dǎo)率。

1.2.4小薊葉片愈傷組織增殖。

單因素條件下，確定2，4D（0、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/L）、6BA（0、0.1、0.3、0.5、0.8 mg/L）、NAA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）對小薊愈傷組織增殖的影響及適宜條件。選擇生長旺盛、有光澤的小薊愈傷組織，剪成約6 mm×6 mm×6 mm大小接種于不同的愈傷組織增殖培養(yǎng)基上。培養(yǎng)21 d后，計算愈傷增殖率，觀察愈傷組織狀態(tài)，確定小薊愈傷組織增殖適宜的激素濃度范圍。

2結(jié)果與分析

2.1單因素條件下植物生長調(diào)節(jié)劑對小薊葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

單因素結(jié)果顯示（表1），2，4D對小薊葉片愈傷組織誘導(dǎo)率最高，最早6 d即可誘導(dǎo)出愈傷組織；在0.4～2.0 mg/L范圍內(nèi)，誘導(dǎo)率為100%，愈傷組織呈白綠色，細(xì)胞透明度均較低；在0.8 mg/L條件下，21 d愈傷組織重量誘導(dǎo)系數(shù)最高，達(dá)46.91，愈傷組織生長狀態(tài)最優(yōu)。

6BA對愈傷組織誘導(dǎo)率一般，愈傷組織出現(xiàn)時間早于對照3～4 d；在0.4～1.5 mg/L范圍內(nèi)，均能誘導(dǎo)得到愈傷組織，質(zhì)量較差，褐化嚴(yán)重；在0.9 mg/L條件下，21 d愈傷組織重量誘導(dǎo)系數(shù)最高，達(dá)15.09。

NAA對愈傷組織誘導(dǎo)率較好，愈傷組織出現(xiàn)時間早于對照4～5 d；在1.0～3.0 mg/L條件范圍內(nèi)，均能誘導(dǎo)得到愈傷組織，有褐化現(xiàn)象；在2.0 mg/L條件下，愈傷組織重量誘導(dǎo)系數(shù)最高，達(dá)26.65，愈傷組織出現(xiàn)的時間較短，生長狀態(tài)較好。

2.2正交試驗優(yōu)化小薊葉片愈傷組織誘導(dǎo)

正交試驗結(jié)果顯示，9種培養(yǎng)基對小薊葉片愈傷組織均有較高誘導(dǎo)率，均達(dá)100%，愈傷組織呈白綠色或黃綠色，細(xì)胞透明度均較低（表2和圖1）。

極差分析結(jié)果顯示，NAA不同濃度重量誘導(dǎo)系數(shù)的極差最大，NAA對小薊葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響最大，3種植物生長調(diào)劑對小薊葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響主次順序為NAA>6BA >2，4D。從誘導(dǎo)系數(shù)平均值分析可知，最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合為MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L。驗證得到，該培養(yǎng)基中能獲得最優(yōu)誘導(dǎo)效果，愈傷組織呈白綠色，質(zhì)地松軟，愈傷組織重量誘導(dǎo)系數(shù)為113.06，為所有激素處理最高（圖2）。

2.33種激素對小薊葉片愈傷組織增殖的影響

單因素試驗顯示（表3），6BA對小薊愈傷組織增殖效果較好，愈傷組織團較大，呈淡綠或綠色，細(xì)胞透明度均低，在0.3 mg/L條件下，愈傷組織增殖率最高；2，4D和NAA對小薊愈傷組織增殖效果較差，愈傷組織團較小，誘導(dǎo)率低，呈白色或淡青色，較為松軟，不適合小薊愈傷組織的增殖培養(yǎng)。因此，確定MS+6BA 0.3 mg/L為小薊愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基。

3結(jié)論與討論

MS培養(yǎng)基無機鹽濃度較高，適合植物組織培養(yǎng)[8]。試驗中選擇MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。植物調(diào)節(jié)劑是植物愈傷組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。2，4D、6BA、NAA植物調(diào)節(jié)劑在一定范圍內(nèi)均能促進植物愈傷組織培養(yǎng)[7，9-10]。

2，4D、6BA、NAA 3種激素對小薊愈傷組織誘導(dǎo)及增殖

均有不同程度的影響。單因素試驗條件下，3種激素均能成

功誘導(dǎo)出小薊葉片愈傷組織，最佳濃度分別是2，4D 0.8 mg/L、6BA 0.9 mg/L、NAA 2.0 mg/L，其中2，4D的誘導(dǎo)效果最佳，NAA對小薊葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響最大。3種激素配合使用，在MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)效果最好。在2，4D 和NAA單因素條件下，小薊愈傷組織增殖率極低，有褐化現(xiàn)象，不適于增殖培養(yǎng)；6BA對小薊愈傷組織增殖率相對較高，MS+6BA 0.3 mg/L培養(yǎng)基為愈傷組織增殖的最適條件。

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