骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦缺血大鼠Notch1-Dll4信號(hào)通路的影響

作者單位：1 350000福建醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2 350000福建國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心

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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦缺血大鼠Notch1-Dll4信號(hào)通路的影響

林菲菲1熊慧玲2

作者單位：1 350000福建醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2 350000福建國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心

【摘要】目的 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦缺血后Notch1-Dll4信號(hào)通路的影響。方法 60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，MCAO組，BMSC組，DAPT組。制備大鼠MCAO模型，BMSC組及DAPT組分別于造模成功后24 h經(jīng)側(cè)腦室注入BMSCs或含DAPT的BMSCs，術(shù)后4 d、7 d、14 d取腦，計(jì)數(shù)腦缺血周邊區(qū)微血管數(shù)量，RT-PCR法檢測(cè)Notch1、Dll4的表達(dá)。結(jié)果 BMSC組大鼠腦缺血周邊區(qū)的微血管數(shù)量明顯多于MCAO組及DAPT組（P＜0.05）；BMSC組大鼠Notch1、Dll4表達(dá)水平較MCAO組及DAPT組明顯增高（P＜0.05）。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可能通過上調(diào)Notch1-Dll4信號(hào)通路的表達(dá)來促進(jìn)大鼠腦缺血周邊區(qū)血管新生。

【關(guān)鍵詞】腦缺血；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；Notch1

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）可能通過促進(jìn)血管新生來改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能［1］，在血管新生過程中，VEGF對(duì)血管發(fā)育的啟動(dòng)至關(guān)重要，而Notch1-Dll4信號(hào)通路可通過抑制新生血管過量芽生，促進(jìn)新生血管網(wǎng)的正常構(gòu)建［2］，本研究予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)腦缺血大鼠，檢測(cè)腦組織中新生血管情況及Notch1-Dll4信號(hào)通路表達(dá)情況，進(jìn)一步探討B(tài)MSCs促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制。

1　主要材料

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為GIBIC0公司產(chǎn)品；兔抗人Ⅷ因子多克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

2　方法

2.1 SD大鼠BMSCs細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取體重60～80 g的清潔級(jí)雄性SD大鼠，分離兩側(cè)股骨，暴露骨髓腔，反復(fù)沖洗，將骨髓懸液過濾并離心后，棄上清，重懸細(xì)胞后移至培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后去除未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液，后每3 d換液1次，原代細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80% ～90%時(shí)行傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞進(jìn)行移植。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)

60只雄性清潔級(jí)成年SD大鼠，體重200～250 g。隨機(jī)分為Sham組、MCAO組、BMSC組、DAPT組，每組15只，線栓法制備MCAO模型，BMSC組于造模成功后24 h經(jīng)側(cè)腦室注射30 μl含l×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，DAPT組于造模成功后24 h經(jīng)側(cè)腦室注射30 μl含有γ分泌酶抑制劑（DAPT，Notch信號(hào)通路特異性抑制劑，濃度為50 ug/m1）的BMSCs懸液。各組再按不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分成3組，每組5只，術(shù)后4 d、7 d、14 d取材。

2.3 微血管密度（microvessel density，MVD）檢測(cè)

冰凍切片標(biāo)本予兔抗人Ⅷ因子抗體行免疫熒光染色。按Weidner等［3］方法行MVD計(jì)數(shù)，每單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，每個(gè)標(biāo)本取2～3張切片，每張切片在低倍鏡下選擇同一皮質(zhì)缺血周邊區(qū)的5個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞染色密集區(qū)，轉(zhuǎn)至200倍熒光顯微鏡下進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，取平均值作為微血管密度。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)Notch1，Dll4的表達(dá)

（1）取大鼠缺血周邊區(qū)腦組織提取總RNA。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：嚴(yán)格按MBI Fermentas公司試劑盒說明進(jìn)行。（3）PCR擴(kuò)增。（4）電泳：擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行吸光度（OD值）的半定量分析，結(jié)果以目的基因與β-actin OD值的比值表示。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，每組樣本結(jié)果用（x-±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)，P < 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1 細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)

原代培養(yǎng)細(xì)胞24 h后開始貼壁，3 d時(shí)可見貼壁細(xì)胞呈典型的成纖維細(xì)胞樣外觀，10 d左右細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%～90%融合，呈均一長(zhǎng)梭形，傳代細(xì)胞呈均勻分布，生長(zhǎng)迅速，約4～5 d可鋪滿瓶壁，細(xì)胞呈梭形。

3.2 缺血周邊區(qū)腦組織MVD分析

差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05，表1），而加用DAPT后BMSCs促血管增生作用受到明顯抑制，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01，表1）。

注：a：P＜0.05 vs. MCAO組；b：P<0.01 vs. DAPT組

3.3 腦缺血周邊區(qū)Notch1，Dll4 mRNA的表達(dá)，見表2。

4　討論

研究表明將BMSCs移植到腦缺血大鼠體內(nèi)后，腦缺血區(qū)新生血管數(shù)量明顯多于對(duì)照組，促進(jìn)了腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能是腦缺血區(qū)的血管生長(zhǎng)因子VEGF等的表達(dá)水平上調(diào)［1］。兩種細(xì)胞均由血管內(nèi)皮細(xì)胞分化而來，受VEGF 與Notch1-Dll4信號(hào)通路共同調(diào)控。本研究提示，缺血后4 d在腦缺血周邊區(qū)即可見Notch1和Dll4 mRNA表達(dá)升高，7 d達(dá)到高峰，之后減弱，BMSCs移植組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Notch1和Dll4 mRNA的表達(dá)明顯高于MCAO組，而加用DAPT后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Notch1 和Dll4 mRNA的表達(dá)明顯受到抑制，提示BMSCs的確可促進(jìn)大鼠腦缺血周邊區(qū)Notch1-Dll4信號(hào)通路的表達(dá)［2-3］；同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)缺血后4 d在腦缺血周邊區(qū)即可見新生微血管，隨著天數(shù)增加，微血管數(shù)量逐漸增多，與Notch1，Dll4 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致，表明缺血性腦損傷后腦組織新生血管的形成可能與BMSCs移植后促進(jìn)腦組織中Notch1-Dll4信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

表2　大鼠腦缺血周邊區(qū)Notch1、Dll4 mRNA表達(dá)情況 （n=5， x- ±s）

參考文獻(xiàn)

［1］ 金志賢，王清，畢虹，等.間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠肺氣腫的療效及其可能機(jī)制［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，95（22）：1731-1735.

［2］ 呂曉霞，黃誠(chéng)，尹至，等.自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效觀察［J］.中華細(xì)胞與干細(xì)胞，2015，5（2）：28-32.

［3］ 孫佳佳，周軍，楊惠林.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的研究進(jìn)展［J］.中華創(chuàng)傷，2015，31（6）：568-570.

Effects of Bone Mesenchymal Stem Cells on the Expression of Notch1-Dll4 Signaling Pathway in the Brain of Rats With Focal Cerebral ischemia

LIN Feifei1XIONG Huiling21 The third hospital affiliated to fujian medical university neurology，F(xiàn)uzhou 350000， China，2 Fujian international travel health care center， Fuzhou 350000，China

【Abstract】

Objective To investigate the effects of BMSCs on the expression of Notch1-Dll4 in the brains of rats with focal cerebral ischemia. Method Sixty male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups： Sham group， MCAO group， BMSC group， DAPT group. 24 hours after MCAO，BMSCs were injected into the lateral ventricle of rats in BMSC group， and the same dose of BMSCs contained DAPT was given to the rats in DAPT group. Rats are sacrificed at 4 d， 7 d and 14 d after MCAO. The amount of were counted， and the level of Notch1， Dll4 were detected by RT-PCR. Results The amount of microvessels increased in BMSC group （P＜0.05）. Compared with the MCAO group， the Notch1， Dll4 expression in ischemic brain was upregulated （P＜0.05）. Conclusion BMSCs can improve the by upregulating the expression of Notch1-Dll4 signaling pathway after MCAO in rats.

【Key words】Cerebral ischemia，BMSCs，Notch1

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.26.112

【文章編號(hào)】1674-9316（2015）26-0154-03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【中圖分類號(hào)】R683.42