利用SELDI-TOF MS篩選不同中醫(yī)證型胃癌的差異蛋白

工作單位：1 030013山西省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科；2 030013山西省腫瘤醫(yī)院分子生物室 通訊作者：王福花 Email：wangfuhua.168@163.com

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利用SELDI-TOF MS篩選不同中醫(yī)證型胃癌的差異蛋白

吳 乾1王福花2

工作單位：1 030013山西省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科；2 030013山西省腫瘤醫(yī)院分子生物室 通訊作者：王福花 Email：wangfuhua.168@163.com

【摘要】目的 探討利用表面增強(qiáng)激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF MS）比較不同中醫(yī)證型胃癌患者的血清蛋白指紋圖譜并篩選其差異蛋白。方法 選取本院收治的36例胃癌患者，依據(jù)中醫(yī)證型的不同分為虛證組19例與實(shí)證組17例。針對兩組樣本均應(yīng)用SELDI TOF-MS檢測其血清的蛋白指紋圖譜，并通過相關(guān)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析。結(jié)果 實(shí)證組與虛證組患者中4 620 m/z的蛋白質(zhì)峰具有顯著差異，其原始判別中特異度為94.1%（16/17），靈敏度為94.7%（18/19），準(zhǔn)確率為94.4%（34/36）。結(jié)論 應(yīng)用SELDI-TOF MS檢測胃癌患者的蛋白指紋圖譜對其中醫(yī)辨證分型具有可靠的篩選作用，能夠?qū)χ嗅t(yī)治療起到一定的指導(dǎo)作用。

【關(guān)鍵詞】表面增強(qiáng)激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜；胃癌；中醫(yī)證型

胃癌是臨床中發(fā)病率與致死率均較高的惡性腫瘤疾病之一，當(dāng)前臨床治療多采用手術(shù)、放化療等措施來提高患者生存時(shí)間，但其治療效果往往不容樂觀。傳統(tǒng)中醫(yī)依靠對患者進(jìn)行合理辨證分型來給予針對性治療［1］，對患者癥狀改善、生存時(shí)間延長以及生活質(zhì)量提升均存在顯著作用。但以往針對惡性腫瘤的辨證分型多依賴于醫(yī)師相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，并無確切臨床標(biāo)準(zhǔn)，本次研究中利用SELDI-TOF MS技術(shù)通過蛋白指紋圖譜對不同證型胃癌患者進(jìn)行篩選，旨在為中醫(yī)治療提供更可靠依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的36例胃癌患者作為研究對象，所有病例均根據(jù)不同中醫(yī)證型劃分為虛證組19例與實(shí)證組17例。虛證組中男性10例，女性9例，平均年齡（58.9±9.3）歲；實(shí)證組中男性9例，女性8例，平均年齡（59.3±9.7）歲。本組胃癌病例中均無合并其他組織器官嚴(yán)重病變者。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 采用美國Ciphergen公司提供的蛋白質(zhì)指紋儀與CM10芯片，PBSⅡ芯片閱讀機(jī)，Protein Chip software閱讀軟件，Biomarker Wizard（BMW）數(shù)據(jù)分析軟件。醋酸鈉（NaAC）、乙腈（CAN）、三氟乙酸（TFA）、HPLC水、能量吸收分子-芥子酸（SPA）等均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2.2 操作方法

（1）血清處理及檢測：針對所有樣本均開展空腹采血，通過離心處理獲得血清標(biāo)本后置于-80℃冰箱中保存待用。使用時(shí)血清標(biāo)本在4℃解凍，10 000 r/ min離心2 min。取離心后的血清5 ul，加入195 ul醋酸鈉緩沖液（50 mmol/L NaAc pH4.0）稀釋，10 000 r/min離心2 min待用。

（2）蛋白質(zhì)芯片的檢測：①CM10蛋白質(zhì)芯片預(yù)處理：取出CM-10型芯片，將CM10芯片安裝于加樣器（bioprocessor）內(nèi)，向A-H加樣孔中各加入200 ul醋酸鈉緩沖液，振蕩5 min，棄去緩沖液， 重復(fù)上述操作1次。每孔中加入稀釋后的待測血清150 ul， 室溫振蕩孵育1 h后甩去緩沖液，每孔加入200 ul醋酸鈉緩沖液，振蕩3 min， 棄緩沖液后，重復(fù)上述操作1次，最后每孔加入200 ul HPLC水，立刻棄去。卸下加樣器，待芯片表面自然晾干后，每孔加人1 ul飽和基質(zhì)SPA （用等體積80 ul CAN和1% TFA溶解），風(fēng)干，即可讀取芯片信息。②蛋白芯片檢測：芯片風(fēng)干后置PBSⅡc型質(zhì)譜儀讀取芯片信息。設(shè)置激光強(qiáng)度為180，檢測靈敏度8，檢測上限20 000 m/z，優(yōu)化收集數(shù)據(jù)范圍1 000～10 000 m/ z，信號收集位置從20～80。其蛋白含量為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z為橫坐標(biāo)［2］繪制出蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。

（3）數(shù)據(jù)處理：應(yīng)用質(zhì)譜儀處理時(shí)依據(jù)質(zhì)荷比不同蛋白質(zhì)飛行時(shí)間差異表現(xiàn)不同圖譜差異［3］，其質(zhì)荷比M/Z=（2U/L2）t2，其中飛行速度為v，加速飛行電場電壓為L，t=L/v，電壓為U。再通過蛋白質(zhì)離子束經(jīng)過檢測器所表現(xiàn)出的瞬時(shí)電流來計(jì)算蛋白質(zhì)相對含量。用Ciphergen ProteinChip軟件讀取芯片，收集原始數(shù)據(jù)，繪制蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。根據(jù)蛋白指紋圖譜進(jìn)行差異蛋白的篩選：應(yīng)用Biomarker Wizard（BMW）軟件分析胃癌實(shí)證組與虛證組患者兩組間相同質(zhì)核比蛋白質(zhì)峰表達(dá)差異的P值，篩選出兩組間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。

2　結(jié)果

通過軟件分析可見，在實(shí)證組與虛證組患者蛋白指紋圖譜中4 620 m/z的蛋白質(zhì)峰具有顯著差異，見圖1，其原始判別中特異度為94.1%（16/17），靈敏度為94.7%（18/19），準(zhǔn)確率為94.4% （34/36），見表1。

圖1　胃癌實(shí)證組與虛證組患者的蛋白指紋圖譜4 620 m/z的蛋白質(zhì)峰具有明顯的表達(dá)差異

表1　實(shí)證組與虛證組的原始判別結(jié)果（n）

3　討論

目前，針對胃癌患者采用傳統(tǒng)中醫(yī)治療的臨床效果與價(jià)值逐漸得到了廣泛認(rèn)可，其治療過程中可有效避免手術(shù)與放化療等方案對患者所產(chǎn)生的機(jī)體損傷程度，并且在癥狀改善、生存時(shí)間延長等預(yù)后情況中均可獲得滿意效果。而中醫(yī)治療的開展主要依托于合理的辨證分型，使得中醫(yī)辨證分型方式成為臨床中研究的重點(diǎn)課題之一。SELDI-TOF MS技術(shù)可有效鑒別患者蛋白質(zhì)表達(dá)，已廣泛應(yīng)用于腫瘤疾病的術(shù)前診斷與預(yù)后評估中［4］，通過將有效腫瘤標(biāo)志物的提取來評判疾病的發(fā)生。以往研究中將該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于肺癌患者的中醫(yī)辨證分型中［5］，并獲得了滿意的研究效果，成功發(fā)現(xiàn)不同證型患者的蛋白圖譜表達(dá)差異。為進(jìn)一步證實(shí)該項(xiàng)技術(shù)在胃癌患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究分別選取實(shí)證與虛證胃癌患者血清開展SELDI-TOF MS檢測。本研究樣本在相關(guān)檢測與數(shù)據(jù)分析結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，實(shí)證組與虛證組患者通過數(shù)據(jù)處理分析后主要以4 620 m/z蛋白質(zhì)峰具有較明顯差異，通過原始判別統(tǒng)計(jì)處理后該質(zhì)荷比的特異度為94.1%，靈敏度為94.7%，準(zhǔn)確率為94.4%。綜合上述研究數(shù)據(jù)分析，蛋白指紋圖譜表現(xiàn)對不同中醫(yī)證型胃癌患者具有較好的篩選作用，可提高辨證分型的合理性。

綜上所述，應(yīng)用SELDI-TOF MS技術(shù)檢測胃癌患者的蛋白指紋圖譜對其中醫(yī)辨證分型具有可靠的篩選作用，能夠確保中醫(yī)治療效果的有效發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

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Screening of Different Protein of Different Patterns of TCM Syndrome in Gastric Cancer by SELDI-TOF MS

WU Qian1WANG Fuhua21 Traditional Chinese Medicine Department，Tumor Hospital of Shanxi Province，Taiyuan 030013，China，2 Molecular biology room，Tumor Hospital of Shanxi Province，Taiyuan 030013，China

【Abstract】

Objective To screen different protein of different patterns of TCM syndrome in gastric cancer by SELDI-TOF MS. Methods To tally 36 gastric cancer patients were enrolled in this study. Their patterns of TCM syndrome were diagnosed， 19 deficiency patterns of TCM syndrome and 17 excess patterns of TCM syndrome respectively. We detect the serum protein fingerprint of two groups samples using SELDI-TOF MS. Results By comparing protein fingerprint of two groups， it found significant differeration， the specificity 94.1%， the sensitivity 94.7%， the accuracy 94.4%， respectively. Conclusion There was reliable screening effect to distinguish different patterns of TCM syndrome in gastric cancer， by detecting the serum protein fingerprint of two groups samples using SELDI-TOF MS. It can play a guiding role to TCM treatment.

【Key words】SELDI-TOF MS，Gastric cancer，Pattern of TCM syndrome

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.26.076

【文章編號】1674-9316（2015）26-0105-03

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B

【中圖分類號】R273