殼聚糖修飾碳納米管載藥體系的制備及性狀的考察

作者單位：450016鄭州市第七人民醫院藥學部

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殼聚糖修飾碳納米管載藥體系的制備及性狀的考察

李艷鳳 關 動

作者單位：450016鄭州市第七人民醫院藥學部

【摘要】目的 構建難溶性藥物具有腫瘤靶向性，緩釋性的轉運載體。方法 用混酸將碳納米管切斷并氧化，后用天然多糖殼聚糖進行修飾，提高其生物相容性，然后利用殼聚糖分子中的氨基與葉酸分子中羧基進行酰胺化的反應，得到具有靶向的藥物載體，最后連接上難溶性的抗腫瘤藥物2-甲氧基雌二醇。結果 成功制備2-ME-FA-CHI-SWNTs腫瘤靶向藥物載運系統。結論 制備的載藥體系比較穩定，粒徑電位較理想。

【關鍵詞】碳納米管；殼聚糖；葉酸；2-甲氧基雌二醇

2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME）為體內雌二醇的代謝產物，對多種腫瘤細胞具有抑制作用，不良反應發生率小［1］。但2-ME是一種難溶性藥物，胃腸道吸收差，血漿消除率快，生物利用度低。所以如何提高該藥物溶解度，并使其在體內達到一個長期有效的血藥濃度是該藥物研究的重難點。

靶向給藥系統是利用具有一定特異性的載體將藥物定向作用于腫瘤組織， 而不影響正常組織細胞功能， 從而提高療效、減少毒副作用的一種給藥系統［2］。該系統中以碳納米材料中的碳納米管（SWNTs）為代表，在生物醫藥領域的應用得到廣泛研究。碳納米管具有細胞膜穿透性并具有較高的藥物負載率，它的穩定性和結構柔性還可延長循環時間并改進結合的藥物分子的生物利用度［3］。但原始碳納米管不能溶解于生理體液中，容易聚集在細胞、器官和組織中［4］。本研究用殼聚糖（Chitosan，CHI）對碳納米管表面進行修飾，改善了其溶解性和生物相容性。有引入葉酸（Folic acid，FA）作靶向因子，最后將2-ME負載于碳納米管側壁，構建了難溶性藥物具有腫瘤靶向性的轉運體系。

1　實驗儀器及試劑

UV-2102型紫外可見分光光度計（尤尼柯儀器有限公司）；Nano-ZS90型激光粒度分析儀（英國馬爾文公司）；DSC/TGA同步分析儀Q600（日本島津）；碳納米管（中國科學院成都有機化學研究所）；殼聚糖（脫乙酰度≥95%）（東京化成公司）；葉酸 （國藥集團化學試劑有限公司）；2-甲氧基雌二醇（純度：99%）（鄭州大學藥學院）。

2　實驗步驟

2.1 碳納米管的酸化

取適量原始碳納米管（r-SWNTs）加入到適量混酸（濃H2SO4/HNO3體積比 3:1）中，超聲對碳納米管進行酸化，冷卻至室溫后，加入一定量超純水稀釋，微孔濾膜過濾，得到的黑色固體用超純水洗至中性，最后將樣品真空干燥過夜，得酸氧化后碳納米管（p-SWNTs）。

2.2 殼聚糖對碳納米管的表面修飾

將適量殼聚糖經自然溶脹過程溶于2%冰醋酸溶液中，加入等量酸化后的SWNTs，超聲0.5 h，磁力攪拌過夜，離心洗滌除去游離的殼聚糖。經超聲重懸于一定量PH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中。

2.3 葉酸的連接

取一定量FA和EDC?HCL，加入適量PBS溶液中，超聲混合均勻后，避光磁力攪拌得到葉酸活化酯。然后將CHI-SWNTs的PBS混懸液和葉酸活化酯溶液混合，繼續避光磁力攪拌過夜。離心棄上清，用PH 7.4的PBS溶液避光透析三天，定時換透析液，通過紫外分光光度計對所換的透析液進行測定，確定游離葉酸的含量，然后將透析液換為超純水再透析三天，除去水溶性雜質，純化產物。最后將透析袋中的保留液取出，避光冷凍干燥得葉酸修飾的碳納米管粉末（FA-CHI-SWNTs）。

2.4 2-ME 的負載

稱取一定量FA-CHI-SWNTs凍干粉和2-ME置于棕色瓶內，加入2 ml甲醇，超聲溶解，然后在冰水浴超聲條件下，逐滴加入8 ml超純水，繼續超聲2 h，后探超，離心棄上清，沉淀超聲重懸后再離心，取上層液得制劑2-ME-FA-CHI-SWNTs，為黑色的混懸液，避光放置無分層沉淀，進行冷凍干燥得固體粉末。

2.5 性狀的檢測

分別從水溶性、熱重分析（TGA）、紫外可見分光光譜（UV）、粒徑和電位及自動插式掃描量熱曲線（DSC）對載藥體系的性狀進行考察。

3　實驗結果與討論

3.1 水溶性考察

原始碳納米管為水不溶性，放置后分層沉淀；酸化碳納米管，水溶性有所改善，放置后仍有沉淀，但無明顯分層；殼聚糖修飾后碳納米管在水中分散良好，呈黑色均一溶液，放置觀察無分層沉淀。酸化碳納米管由于帶有羧基，呈負電，殼聚糖由于帶有大量的氨基，呈正電。兩者由靜電引力而吸附在一起。碳納米管的表面被殼聚糖包裹，水溶性大大提高，可均勻分散在水中且溶液穩定。

3.2 熱重分析（TGA）

圖1　熱重分析（TGA）曲線圖

由圖1可知，酸化后碳納米管的TGA曲線隨溫度的升高變化不大，在200～800℃范圍內降解了10.2%，這主要是因為酸化后碳納米管形成的熱不穩定的羥基和羧基熱降解所造成的，而單純的殼聚糖則在200～300℃內快速降解，溫度達到530℃時已完全降解。在200～800℃范圍內，CHI-SWNTs降解了37%，由此可得出CHI在CHI-SWNTs產物中的質量分數為26.8%。

3.3 紫外可見分光光譜分析

圖2　UV光譜圖（A為p-SWNTs，B為CHI，C為CHI-SWNTs，D為FA-CHI-SWNTs）

由圖2可知，酸化碳納米管在249 nm處出現C=O的紫外特征吸收峰，表明碳納米管酸化成功。殼聚糖本身的紫外吸收特別弱，因此C與A相比無明顯變化，只有C=O的紫外特征吸收峰長移至257 nm。C與D對比FA-CHI-SWNTs在280 nm處出現了FA的紫外特征吸收，可見葉酸連接成功。

3.4 粒徑和電位的考察

圖3　制劑的粒徑及電位掃描圖譜

圖3分別為2-ME-FA-CHI-SWNTs的粒徑及電位，功能化碳納米管的粒徑及電位變化如表1所示。p-SWNTs有羧基帶負電，CHI-SWNTs 有活性氨基變為正電，FA-CHI-SWNTs 因為FA上羧基，所以呈負電。靶向載體負載2-ME后，如圖九所示電位（-26.4±2.3） mV，，能夠在溶液中穩定存在。其粒徑均分布在213 nm左右，符合制劑要求。

表1　功能化碳納米管電位及粒徑的變化

3.5 DSC曲線掃描

固態藥物一般存在多種晶型，而不同晶型在溶解速率、生物利用度和藥效上差別很大。高溫穩定的晶型溶解速率比低溫穩定的晶型快，藥效明顯易吸收，因此在制藥過程中盡量使用高溫穩定的晶型［5］。由圖4可知，2-ME熔點峰為188℃左右，藥物負載于碳納米管之后，2-ME在188℃處熔點峰消失，取而代之在388℃處有峰出現?？梢?-ME通過π-π堆積作用成功負載在碳納米管上，且藥物在載體材料中以高溫穩定的晶型存在。

本研究成功制備了以碳納米管為原材料的靶向給藥載體，并以2-甲氧基雌二醇為模型藥物進行載藥，提高該藥物溶解度，增加其選擇性，以期在體內達到一個長期有效的血藥濃度，為進一步研究打下良好基礎。

圖4　a為2-ME、b為2-ME與空白載體的物理混合粉末、c為制劑粉末的DSC曲線圖

參考文獻

［1］ Ricker J L， Chen Z，Yang X P， el a1．2-Methoxyestradiol inhibits hypoxia-inducible factor 1 alpha ， tumor growth ， and angiogenesis and augment paclitaxel efficacy in head and neck squamous cell carcinoma［J］．Clin Cancer ， 2004，10（24）：8665-8673.

［2］ 王宗花，周成鳳，張菲菲，等.碳納米管藥物載體的研究進展［J］.材料導報，2011，25（7）：76-79.

［3］ Zhang X K，Meng LJ，LuQ H，et a1．Targeted delivery and controlled release of doxorubicin to cancer cells using modified single wall carbon nanotubes ［J］．Biomaterials，2009，30（30）：6041-6047.

［4］ 鄔偉魁，張海燕，楊明，等.碳納米管的載藥及安全研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（15）：261-264.

［5］ 范曉勇.替莫唑胺/紫杉醇復合緩釋系統的構建及其抗膠質瘤性能的實驗研究［D］.山東：山東大學，2011.

The Preparation and Properties of Targeted Delivery System of 2-ME-FA-CHI-SWNTs

LI Yanfeng GUAN Dong Seventh People’s Hospital of Zhengzhou city，Zhengzhou 450016，China

【Abstract】

Objective To prepare the targeted delivery system of 2-ME-FA-CHI-SWNTs. Methods Carbon nanotubes will be cut off and oxidated with mixed acid，modified with natural polysaccharides CHI to improve its biocompatibility and then connected with the target groups FA via the acylation reaction of the amino and carboxyl，finally loaded with the insoluble anticancer drug 2-ME. Results The targeted delivery syste -m of 2-ME-FACHI-SWNTs is successfully prepared. Conclusion The targeted delivery system of 2-ME-FA-CHI-SWNTs prepared by this method is relatively stable. The particle size and the Zeta are better.

【Key words】Carbon nanofubes，Chitosan，Folic Acid，2-methoxyestradio

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.26.073

【文章編號】1674-9316（2015）26-0100-03

【文獻標識碼】B

【中圖分類號】R473.71