反式載脂蛋白A1模擬肽R-D4F對內皮祖細胞黏附及遷移功能的影響

反式載脂蛋白A1模擬肽R-D4F對內皮祖細胞黏附及遷移功能的影響

賀艷紅袁曉晨孫京京朱華江姚丹

(揚州大學第二臨床醫學院心血管內科，江蘇揚州225001)

摘要〔〕目的探討反式載脂蛋白A1模擬肽R-D4F對人內皮祖細胞黏附及遷移功能的影響。方法取新鮮人臍靜脈血，采用密度梯法從中分離、誘導培養人內皮祖細胞，并使用Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1 染料進行雙熒光染色以及流式細胞術進行鑒定。分別給于牛血清白蛋白、順式D-4F(50 μg/ml)及R-D4F(5～50 μg/ml)處理后，采用黏附能力測定實驗及Transwell 小室觀察內皮祖細胞黏附及遷移能力的變化。結果與牛血清白蛋白對照組相比，D-4F顯著增強內皮祖細胞的黏附及遷移功能。相似的是，R-D4F呈劑量依賴性地增強內皮祖細胞的黏附與遷移。結論R-D4F具有與D-4F相似的生物學作用，可促進人內皮祖細胞的黏附及遷移。

關鍵詞〔〕載脂蛋白A1模擬肽；R-D4F；內皮祖細胞；黏附；遷移

中圖分類號〔〕R543.5〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81070096；81270198)；江蘇省自然科學基金資助項目(BK2008220,BK2010324)；江蘇省第四期科教興衛工程項目基金(RC2011045)

通訊作者：袁曉晨(1969-)，女，博士，主要從事冠心病基礎研究。

第一作者：賀艷紅(1988-)，女，碩士，主要從事冠心病基礎研究。

Reverse apolipoprotein A-I mimetic peptide-R-D4F promotes the adhesion and migration of human endothelial progenitor cells

HE Yan-Hong,YUAN Xiao-Chen,SUN Jing-Jing,etal.

Department of Cardiovascular Medicine,the Second Clinical Medical College,Yangzhou University,Yangzhou 225100,Jiangsu,China

Abstract【】ObjectiveTo test the effects of reverse Apolipoprotein A-1 mimetic peptide(R-D4F) on the adhesion and migration of human endothelial progenitor cells(EPCs).MethodsThe mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood by Ficoll density gradient centrifugation which were induced and cultured with special EGM-2 medium. EPCs were identified by cellular fluorescence staining with Dil-ac-LDL and FITC-UEA-I and flow cytometry. EPCs were treated with vehicle(BSA),D-4F(50 μg/ml) and R-D4F(5～50 μg/ml),respectively. The characteristics of adhesion and migration of EPC were measured by cellular adhesive assay and Transwell chamber.ResultsR-D4F significantly improved the ability in adhesion and migration of EPCs compared with DMEM control. Similarly,R-D4F also enhanced the biological characteristics in a dose-dependent manner.ConclusionsR-D4F has similar biological effects with D-4F on EPCs and promotes cell adhesion and migration.

【Key words】Apolipoprotein A-1 mimetic peptide；Reverse-D4F(R-D4F)；Endothelial progenitor cells(EPCs)；Adhesion；Migration

動脈粥樣硬化的發生與循環中內皮祖細胞(EPC)的減少有關〔1〕，外周循環中低EPC水平可作為發生心血管事件的一個獨立危險因素〔2〕。EPC可以在缺血應激誘導下通過歸巢的形式促進血管新生及再內皮化，在內皮維護及修復中起重要作用〔3，4〕。載脂蛋白A1是介導高密度脂蛋白(HDL)發揮抗動脈粥樣硬化作用的關鍵成分〔5〕。由于純化天然HDL成本高昂，采用人工合成載脂蛋白A1模擬肽成為抗動脈粥樣硬化治療的一個有效手段。在當前眾多人工合成的載脂蛋白A1模擬肽之中，D-4F模擬肽具有多種內皮保護機制，包括作為一種抗氧化劑、介導膽固醇從泡沫細胞流出和直接抗炎作用〔6,7〕，而這些模擬肽的氨基酸在疏水端排列順序微妙的調整即可顯示出明顯不同的脂質結合特性和抗炎作用〔8〕。因此，在D-4F基礎上，根據其序列特異設計了一種左手性D-4F鏡像序列的模擬肽，同時兼具右手性和反轉順序的特征，被學者稱之為反式D-4F(R-D4F)。Qin等〔9〕研究顯示，給予apoE缺乏鼠新型模擬肽R-D4F治療可以明顯抑制動脈粥樣硬化的發生，可能與其抗氧化、抗炎癥和保護血管內皮功能有關〔9〕。本課題組新近報道〔10〕，D-4F可顯著增強EPCs的生物學特性，這可能是它發揮抗動脈粥樣硬化的一個新機制。本研究在此基礎上，旨在進一步探討R-D4F是否也可對EPCs發揮類似D-4F樣生物學效應。

1材料與方法

1.1臍帶血收集臍帶血標本來自我院產科，產婦年齡不拘，足月妊娠，無并發癥，術前四項傳播性疾病抗體(包括乙肝表面抗原、丙型肝炎病毒、Ⅰ/Ⅱ型人體免疫缺陷病毒、梅毒抗體)檢查陰性，采集前均征得產婦同意并簽署知情同意書，所有實驗方案獲得我院醫學倫理委員會同意。留取剖宮產產婦新生兒臍帶，每例采集臍靜脈血40～60 ml,采用肝素稀釋抗凝，隨后于4 h內完成單核細胞分離。

1.2主要試劑人淋巴細胞分離液購自天津TBD公司；EGM-2培養基購自LONZA公司；FITC標記抗CD34抗體購自Santa Cruz公司；PE標記抗CD133抗體購自Miltenyi Biotec公司；Dil-ac-LDL購自Invitrogen公司；FITC-UEA-1(FITC-Ulex europaeus agglutinin)購自Sigma-Aldrich公司；載脂蛋白A1模擬肽D-4F及R-D4F均購自輝源生物科技(上海)有限公司；DMEM購自Gibco公司；人纖維連接蛋白購自Millipore公司；胰蛋白酶購自BD公司；Transwell購自CORNING公司。

1.3主要方法

1.3.1細胞培養步驟人纖維連接蛋白以2 μg/cm2濃度包被培養皿，37℃培養箱內孵育過夜。臍靜脈血和PBS在50 ml離心管內按體積 1∶1對倍稀釋、混勻。先向15 ml離心管中加入6 ml人淋巴細胞分離液，然后用無菌吸管吸取同等體積稀釋的臍靜脈血輕輕鋪在淋巴細胞分離液的液面上，盡量保持液面分界清晰。室溫下(18℃～25℃)，水平離心(轉子半徑10 cm)2 500 r/min離心30 min。取出離心管，無菌吸管吸取中間薄層白霧狀單個核細胞層。將單個核細胞置于空離心管中，再加4倍量以上PBS混勻，水平離心機1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，留取管底沉淀物。重復PBS洗滌一次，洗去混雜的血漿蛋白、血小板和淋巴細胞分離液。收集管底的單個核細胞，以1×106/ml濃度將細胞重懸于EGM-2完全培養基中，然后將其接種到6 cm的培養皿中。將培養皿置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中靜置培養。4 d后首次換液,輕輕吸去未貼壁細胞，加入新鮮EGM-2培養基繼續孵育。之后每周換液2次，每天鏡下觀察內皮細胞集落形成情況。待細胞長到培養板70%～80% 融合時，用0.25%胰酶消化后進行傳代培養觀察。

1.3.2細胞雙熒光染色鑒定〔11〕細胞培養至7 d時，使用Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1 雙熒光染色進行EPCs鑒定。37℃下，細胞在含Dil-ac-LDL(2.5 μg/ml) 的培養液中避光孵育4 h，取出用PBS洗滌2次。然后以4%多聚甲醛固定10 min ，PBS漂洗3次后加FITC-UEA-I(10 μg/ml)避光孵育l h。PBS漂洗3次后在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞吞噬Dil-ac-LDL及膜內表面結合FITC-UEA-I的能力。

1.3.3流式細胞術檢測EPCs培養至7 d時，行CD34和CD133免疫熒光雙標記，通過流式細胞儀分析，檢測培養的EPCs中CD34和CD133的陽性率。將計數好的3管細胞(每管約2×107個/ml)4℃300 r/min離心10 min，去除上清，100 μl PBS重懸細胞，其中兩管分別加入10 μl CD34和CD133抗體，充分混勻，避光孵育10 min，加1 ml PBS沖洗，300 g離心10 min，棄上清，加100 μl PBS重懸細胞后上機檢測(按照說明書操作)。

1.3.4細胞黏附能力檢測將培養的EPC首先棄去舊培養基，反復用PBS洗滌后，加無血清的DMEM培養液孵育6～8 h。然后將EPC分為BSA對照組、D-4F(50 μg/ml)組、R-D4F(5，10，50 μg/ml)組。按實驗分組加入不同藥物后，將細胞置于37℃ 培養箱中孵育24 h 。將EPC消化、重懸于完全培養液中，調整細胞濃度為1×105/ml，接種于FN包被的24孔培養板中。每組6孔，每孔500 μl。各組隨機3孔37℃孵育2 h，另外3孔37℃孵育4 h。吸去未黏附的細胞，用PBS輕輕洗滌1次后，顯微鏡下每孔隨機選擇8個視野計數，取均數。

1.3.5細胞遷移功能檢測用24孔Transwell (孔徑8 μm )行體外遷移實驗〔12〕。將培養的EPC首先棄去舊培養基，反復用PBS洗滌后加無血清的DMEM培養基孵育6～8 h。用0.25%胰酶消化EPCs、重懸于完全培養基中，調整細胞懸液濃度為1×105/ml。Transwell下室先加600 μl EGM-2培養基，再根據分組加入不同的干預藥物。上室中加細胞懸液100 μl。將24孔板置于37℃培養箱中孵育12 h。在另外孔中加4%多聚甲醛，將上室轉移到其中，細胞固定15 min。將上室轉移到已經加PBS的孔中，用濕棉簽擦去上室附著細胞，反復擦3次后用PBS浸洗3次。伊紅染色1 min，PBS洗滌后，隨機選擇10個連續顯微鏡視野(200倍)計數遷移到上室膜下的細胞，取均數。

2結果

2.1EPC鑒定4 d后首次換液，輕輕吸棄未貼壁細胞。1 w左右即可見到貼壁細胞團簇，細胞呈長橢圓形。部分細胞伸出偽足，向類圓形和不規則形態轉變。隨著培養時間的延長，細胞逐漸伸長，呈細長條狀分布。取此時細胞進行Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1 雙熒光染色鑒定，結果證實EPCs均可特異性攝取兩種染料(見圖1A)。繼續觀察細胞生長情況，觀察到1 w后細胞生長明顯加速，呈克隆樣生長，逐漸出現大面積團簇狀生長，細胞呈放射條索狀排列。20 d 左右細胞已基本長滿瓶底80%～90%，呈鋪路石樣改變，形態上符合典型的內皮細胞，而且傳代培養后仍保持典型的完整內皮細胞形態特征，見圖1B。采用流失細胞術檢測細胞表面CD34及CD133的表達情況，顯示了分離的細胞具有EPC高表達這些分子的生物學特征(見圖2)。

圖1　EPCs熒光染色鑒定及后期形態特征(×100)

2.2R-D4F處理可增強EPCs的黏附功能與對照BSA相比較，50 μg/ml D-4F孵育過的EPCs貼服在FN包被培養皿上2 h及4 h的細胞數量明顯增多(P<0.05)。以此作為陽性對照，5 μg/ml R-D4F處理即可顯著增加貼附在FN培養皿上2 h及4 h EPCs數量(P<0.05)，但作用弱于50 μg/ml D-4F處理組，而50 μg/ml可進一步增強EPCs的貼附，且與D-4F組比較無顯著差異，見圖3。

2.3R-D4F促進EPC遷移功能與BSA對照相比，50 μg/ml的D-4F處理可顯著增強FPC的遷移功能(P<0.05)。相似的是，R-D4F(5～50 μg/ml) 處理可呈劑量依賴性增強FPC的遷移功能(P<0.05)。且與D-4F組相比，50 μg/ml R-D4F作用強度與同劑量的D-4F作用相當，兩者間比較無統計學意義，見圖4。

圖2　EPCs流式鑒定

與對照組比較：1)P<0.05；與D-4F組比較：2)P<0.05；下圖同 圖3　R-D4F對EPCs貼附能力的影響

圖4　R-D4F促進EPCs遷移

3討論

大量的研究提示，EPCs對血管損傷和高脂血癥引起的動脈粥樣硬化有保護作用〔1〕。正常人外周血中EPC比例較低，其數量約占單個核細胞的0.002%。但有研究顯示，臍帶血中EPC數量相對較多，約為外周血中的10倍。此外，由于EPC在動員過程中需要依賴多種生長因子與細胞外基質的支持〔13〕，因此我們預先在培養板中包被足量纖維蛋白，提供有賴于細胞黏附和分化的基質環境，同時應用富含多種內皮生長因子的培養基，結果我們觀察到，直接采用臍帶血分離EPC，結合密度梯度離心法可得到與先前報道相近純度的EPCs〔14〕。

研究表明，D-4F可通過多種機制發揮內皮保護效應，如抗氧化、介導膽固醇的逆轉運、直接的抗炎作用等。Xie等〔15〕用D-4F干預RAW264.7巨噬細胞，發現D-4F可促進巨噬細胞膽固醇的流出，其機制可能與cAMP-PKA-ABCA1通路有關。Arsell等〔16〕分別對轉基因低密度脂蛋白缺乏小鼠(LDL R-/-)、載脂蛋白E受體缺乏小鼠(載脂蛋白E R-/-)注射和口服模擬肽D-4F，結果表明，D-4F能降低血管粥樣硬化斑塊損害，降低單核細胞趨化作用，增強HDL保護能力。在猴的動物模型上聯合使用D-4F和普伐他汀，也可使HDL具有抗炎特性，提高HDL清除膽固醇的能力〔17〕。而反式載脂蛋白A1模擬肽R-D4F作為左手性D-4F鏡像序列的模擬肽，因為它同時兼具右手性和反轉順序的特征，可能會有助于通過移除LDL上的磷脂接種分子而改變LDL的脂質參數，使LDL分子更能對抗被氧化修飾；此外，體外研究也顯示它比D-4F更能有效抑制脂質過氧化作用〔18〕。 一項臨床前期動物研究也表明，R-D4F能有效抑制載脂蛋白E敲除小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化病變區域的巨噬細胞積聚〔19〕。本課題組新近在小鼠頸動脈結扎模型的研究中也觀察到，采用腹腔注射R-D4F同樣也可有效抑制血管損傷后血管外膜區域內炎癥細胞的浸潤，降低局部炎癥介質的表達而顯著抑制后期血管新生內膜的形成〔18〕。本研究采用D-4F作為陽性對照，與近來報道〔10〕相似的是，R-D4F處理對EPCs也可發揮類似D-4F樣效應，顯著促進EPCs的黏附及遷移，這可能有助于其發揮促進內皮修復、血管保護效應。

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〔2013-12-09修回〕

(編輯徐杰)