慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中核轉錄因子-κB、轉化生長因子-β1表達與氣道重塑的關系

慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中核轉錄因子-κB、轉化生長因子-β1表達與氣道重塑的關系

管頻1于化鵬2李偉1吳智勇1吳潔3陳世良1

(南方醫科大學研究生物學院，廣東廣州510000)

摘要〔〕目的觀察COPD患者肺組織中核轉錄因子(NF)-κB、轉化生長因子(TGF)-β1的表達及與氣道重塑的相關性。方法標本取自40例因肺部孤立性結節行肺葉切除術患者的肺組織，按術前肺功能分為非COPD組(A 組，20例) 及COPD組(B組，20例)。所取肺組織HE染色后光鏡下觀察肺組織的病理形態學改變,以半定量圖像分析法測量小氣道管壁和平滑肌層厚度。用Western印跡法檢測肺組織中NF-κB、TGF-β1的表達。結果①B組NF-κB、TGF-β1表達均高于A組(均P<0.05)，且NF-κB與TGF-β1表達存在正相關(P<0.05)；②肺組織中NF-κB、TGF-β1的表達與單位長度的管壁面積(WAt/Pi,μm2/μm)及單位長度的平滑肌層面積(WAsm/Pi,μm2/μm) 表達均呈正相關(P<0.05)。③FEV1/ FVC、FEV1%預計值分別與NF-κB、TGF-β1的表達呈負相關(P<0.05)。結論COPD肺組織中NF-κB、TGF-β1的表達增加，細胞因子的表達增加使其發揮的生物學效應增強，從而促進氣道重塑，進一步影響肺功能。

關鍵詞〔〕慢性阻塞性肺疾病(COPD)；氣道重塑；轉化生長因子-β1；核轉錄因子-κB

中圖分類號〔〕R56〔

基金項目：海南省自然科學基金(807081)

通訊作者：于化鵬(1960-)，男，博士生導師，教授，主要從事支氣管哮喘發病機制研究。

1海南省人民醫院醫療保健四區

2南方醫科大學附屬珠江醫院呼吸內科3海南醫學院

第一作者：管頻(1980-)，女，主治醫師，碩士，主要從事慢性阻塞性肺疾病氣道重塑研究。

氣道重塑是慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣流受限的主要病理基礎,是COPD病變呈持續發展的關鍵因素〔1，2〕。 在眾多炎癥因子及細胞外基質調節因子中，轉化生長因子(TGF)-β1是同時具有重要的免疫調節和致纖維化活性，故而在氣道炎癥及氣道重塑中占重要地位〔3〕。核轉錄因子(NF)-κB是在肺組織氧化應激、細胞凋亡中活化的主要轉錄因子，它能夠引起許多致炎癥基因的表達上調，從而影響了氣道炎癥及氣道重塑〔4〕。本文探討TGF-β1、 NF-κB的表達與氣道重塑指標的相關性。

1材料與方法

1.1資料選取2009年3～7月因發現肺部孤立性結節于我院胸外科住院擬行行肺葉切除術的40例患者，入選患者近6 w內無急性加重。按術前1 w的肺功能結果分為非COPD組(A組，20例)及與COPD組(B組，20例)。COPD的診斷符合COPD診治指南〔1〕。兩組患者的年齡、性別等無明顯差異。患者均除外先天性心臟病、左心疾病、COPD以外的其他肺疾病以及全身其他系統慢性病變。實驗所需的肺組織取遠離肺癌病灶5 cm以上、無腫瘤浸潤的外周肺組織。兩組受試者性別、年齡之間無明顯差異(P>0.05)。見表1。

1.2標本采集及HE染色處理手術取下肺組織標本,迅速用10%福爾馬林充分浸泡固定12 h,常規梯度酒精脫水,石蠟包埋。取上述人肺組織石蠟塊,切片(5 μm) ,HE染色后,光鏡下觀察其病理形態學改變。

表1　兩組受試者一般資料及肺功能比較

1.3支氣管形態學測量方法隨機選取HE切片中內周長<1 000 μm,長徑/短徑≤2,較規整的小支氣管,每個標本選3～6個支氣管橫截面積,采用META MORPH 圖像分析系統(美國Universal Imaging Corporation) 進行測量和計算，以單位長度的管壁面積表示管壁厚度,同樣以單位長度的平滑肌層面積表示平滑肌層厚度〔5〕。

1.4Western印跡檢測外周氣道肺組織TGF-β1、NF-κB蛋白質表達采用Western印跡法檢測外周氣道肺組織的NF-κB p65(分子量65 kD)、TGF-β1(分子量12.5 kD)的表達，以GAPDH為內參蛋白(分子量36 kD)。應用RIPA蛋白裂解液從肺組織中提取蛋白質,考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度后于-80 ℃保存。取核蛋白樣品加等體積的2×電泳樣品緩沖液加熱變性后,以20 μg蛋白/泳道上樣,經10% SDS-PAGE電泳后,電轉移至硝酸纖維膜。予麗春紅S染色確定轉膜情況并標記蛋白質標準參照物位置。用5%脫脂奶粉封閉后,先后加入一抗(NF-κB p65抗體或TGF-β1抗體)及辣根過氧化物酶標記的二抗,DAB顯色劑顯色,結果:陽性區域顯深棕色。拍攝濾膜照片,并通過凝膠成像系統定量掃描灰度值，NF-κB p65/GAPDH吸光度比值來表示。

1.5統計學方法采用SPSS13.0軟件進行t及χ2檢驗。

2結果

2.1兩組肺組織TGF-β1、NF-κB表達比較TGF-β1和NF-κB表達在B 組均明顯高于A組(P<0.05)。見表2，圖1。

2.2兩組支氣管形態學測量結果比較管壁厚度、平滑肌厚度在B組均明顯高于A組(P<0.05)。見表2。

2.3相關分析COPD患者外周肺組織TGF-β1表達與NF-κB的表達正相關(r=0.783,P=0.000)。NF-κB的表達與管壁厚度、平滑肌厚度以及肺功能指標FEV1/ FVC、FEV1%預計值均正相關(r值分別為：0.882、0.629、0.797、0.738，P值均0.000),TGF-β1與管壁厚度、平滑肌厚度以及肺功能指標FEV1/ FVC、FEV1%預計值均正相關(r值分別為：0.752、0.694、0.968、0.706,P值均0.000)。

圖1　Western印跡法檢測兩組肺組織NF-κB、TGF-β1表達

組別TGF-β1NF-κB管壁厚度(μm2/μm)平滑肌厚度(μm2/μm)A組2.93±0.738.68±3.6758.16±9.836.75±1.79B組5.07±0.6022.69±7.8381.46±8.3814.87±4.11t/P值10.156/0.0007.244/0.0008.065/0.0008.102/0.000

3討論

COPD是肺組織對于有害顆粒或氣體產生的異常炎性免疫反應相關的復雜綜合征，大量的實質、炎癥細胞和細胞因子參與了COPD的發生和發展過程〔6〕。在氣道炎癥和氣道重塑中，TGF-β1在細胞外基質活化后，通過smad依賴或非依賴信號轉導途徑，TGF-β1調節不同類型細胞的功能，例如Tp、Th17，特別是Treg(調節性T細胞)及成纖維細胞來促進炎癥反應、合成細胞外基質蛋白及促進膠原沉積等〔3〕，從而引起氣道修復、重塑，也就是說，TGF-β1是氣道重塑的閥門，是這個過程的關鍵。已有研究發現， COPD患者氣道上皮及肺泡巨噬細胞中TGF-β1表達增加，且隨吸煙量增多而升高〔7，8〕；且COPD患者TGF-β1的表達水平與小氣道阻塞程度有關，在外周氣道的狹窄、纖維化中起到重要作用〔9，10〕。而本實驗發現，COPD患者外周肺組織中TGF-β1表達均明顯高于非COPD者,并與管壁厚度、平滑肌厚度及肺功能呈正相關，這與以前關于TGF-β1在COPD患者氣道重塑中的重要作用的研究是一致的。

NF-κB參與許多炎性因子的基因調控，例如白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α,ET-1、ICAM-1及生長因子等〔11〕。在TGF的上游啟動子上也存在著NF-κB反應元件〔12〕，有研究發現中性粒細胞彈性蛋白酶通過NF-κB途徑誘導了人氣道平滑肌TGF-β1的表達〔13〕。另一方面，也有研究發現TGF-1的活化因子組織轉谷氨酰胺酶(tTG)基因的啟動子中含有NF-κB的結合位點，因而NF-κB能從多方面上調TGF-β1的表達〔14〕。本實驗發現，COPD病程中,NF-κB可能啟動了TGF-β1基因的轉錄,上調了TGF-β1的表達，進一步發揮生長因子的多方面效應，促進氣道重塑而影響肺功能。

4參考文獻

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〔2013-08-20修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)