東北粗皮蛙線粒體DNA遺傳多樣性分析

李學龍，楊寶田

(沈陽師范大學化學與生命科學學院，遼寧沈陽110034)

東北粗皮蛙(Rugosa emeljanovi)為蛙科(Ranidae)，粗皮蛙屬(Rugosa)動物［1］。其模式標本產地在黑龍江省尚志市一面坡鎮［2］，分布范圍主要位于東北亞地區。已知在國內分布于東北三省的東部地區:吉林省包括吉林市、集安市、撫松縣和榆樹市;黑龍江省見于尚志市;遼寧省分布相對較廣，在丹東、桓仁、清源、本溪、莊河、寬甸、大連以及岫巖等市縣均有棲息。在國外主要分布于俄羅斯遠東和朝鮮半島。東北粗皮蛙主要棲息在水田、流水緩慢的河流和山間溪流及水渠岸邊，白天隱藏于草叢中、溪流附近的石縫或石塊下及水底的水草間，夜晚在水田邊、水域岸邊捕食［1］。

近年來，許多學者對粗皮蛙的分類地位看法不一。粗皮蛙原隸屬于蛙科(Ranidae)蛙屬(Rana)，東北粗皮蛙曾被認為是日本粗皮蛙(Rana rugosa)的同物異名［3］或其亞種(R.rugosa emeljanovi)［4］，1990年費梁等以日本粗皮蛙Rana rugosa為模式物種建立了粗皮蛙屬(Rugosa)，并將中國東北地區樣本恢復為有效種，學名定為Rugosa emeljanowi。而Dubois(1992)把粗皮蛙屬Rugosa作為蛙屬Rana的亞屬，即粗皮蛙亞屬Rana(Rugosa)［5］。基于分子系統發育分析，Frost et al.(2014)仍將粗皮蛙合并于腺蛙屬 Glandirana 中［6］。

國內對于粗皮蛙的研究報道相對較少。趙文閣等(2004)［7］曾對遼寧產粗皮蛙的染色體組型做了研究，吳貫夫和趙蕙(2006)［8］詳細描述了我國產粗皮蛙骨骼系統形態結構特征。兩棲動物性別決定的復雜性和特殊性使得很多學者將目標集中于這一領域的研究。Miura(2007)［9］研究發現，粗皮蛙具有XX/XY和ZZ/ZW兩種性別決定系統，而對性別分化及決定起作用的基因較多，如常染色體基因DMRT1、FOXL2、SOX9等，性染色體基因DAX1、SF1、SOX3等，并且這些基因的作用機制也較為復雜［10－16］。有關粗皮蛙遺傳多樣性研究多為韓國學者報道。Park(1990)［17］和Lee et al.(1991)［18］先后利用染色體核型分析探討了東北粗皮蛙的遺傳多態性。隨后，Lee et al.(1992)［19］又應用限制性片段長度多態性(RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism)標記技術分析了粗皮蛙線粒體DNA在不同種群間的長度變異。DNA測序技術的普及和應用，使得研究者能夠從最基本的DNA序列組成和基因結構分析來探討生物的遺傳變異。韓國學者Lee et al.(1999)［20］通過對線粒體細胞色素b基因(Cytb)部分核酸序列分析，探討了韓國分布的東北粗皮蛙不同種群遺傳多樣性。本文通過對中國東北分布的粗皮蛙線粒體Cytb基因和控制區(D－loop)部分DNA序列進行研究，探討其遺傳多態性和種群遺傳結構，以期為保護生物學研究提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

野外采集東北粗皮蛙樣本29個，分別來自于吉林吉安(Re01～Re04)、遼寧蓋州(Re05、Re06)、海城(Re07 ～ Re09)、新賓(Re10 ～ Re12)、莊河(Re13 ～ Re17)、岫巖(Re18 ～ Re20)、桓仁(Re21 ～ Re25)、寬甸(Re26)和丹東(Re27～Re29)9個地理種群(圖1)。粗皮蛙樣本取后肢趾尖后放生，指尖組織置于95%乙醇中固定并存放于－25℃冷藏箱中保存待用。

1.2 基因組DNA的提取、PCR擴增及測序

用AXYGEN試劑盒(康寧生命科學有限公司)提取基因組DNA，具體操作方法按照試劑盒說明書進行。提取的DNA存放在－20℃冰箱內保存待用。線粒體控制區DNA擴增所用引物為本實驗室設計篩選，其序列為Lrug:5’－AGCTCTGACCTTCGCTTGAT－3’;Hrug:5’－CCAGGAGCCCTCGTTATCAT－3’。線粒體Cytb基因擴增所用引物為 L14850:TCTCATCCTGATGAAACTTTGGCTC［20］，Cytbs:TAAATCTCACCCCCTCCTCAA［21］。引物由北京華大基因有限公司合成。每個PCR反應總體積為25μl，包括18.9μl超純水、2.5μl Buffer緩沖液(含 MgCl2)、2.0μl 10mmol·L－1dNTP、1.0 μl 10mmol·L－1引物(上下游引物各0.5μl)、0.125 μl Taq DNA 聚合酶。在ABI2720 PCR儀上進行擴增，PCR反應條件為94℃預變性5 min后進入以下循環:94℃變性30 s、50℃退火50 s、72℃延伸1 min共40個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京華大基因有限公司測序。

圖1 東北粗皮蛙樣本采集地點

1.3 序列分析

所測得序列經Blast搜索驗證其可靠性，利用Clustal X軟件［22］對DNA序列進行多重比對并輔以手工編輯校正。用MEGA6.0［23］軟件分析不同序列間的堿基組成和變異位點，并計算基于Kimura雙參數模型的遺傳距離。用 DNAsp5.0［24］計算單倍型多態性(Hapltype diversity，H)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)等遺傳多樣性指數。利用Arlequin3.1［25］軟件進行遺傳結構分析和分子變異分析(Analysis of molecular variance，AMOVA)。單倍型網絡關系圖用 TCS 1.20［26］軟件完成。

2 結果

2.1 線粒體DNA控制區序列堿基組成和變異位點。

東北粗皮蛙線粒體DNA控制區經PCR擴增后得到長度為587bp的片段，經Blast比對分析確定為東北粗皮蛙線粒體DNA控制區部分序列。在該序列中，A、T、G與C四種核苷酸的平均含量分別為31.7%、33.6%、12.9%和21.8%，A和T的含量為65.3%，明顯高于G和C的含量。29個樣本序列存在6個變異位點，共定義8個單倍型，單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數3個遺傳多樣性參數分別為0.525、0.001、0.749。其中Hap1為9個地理種群共享單倍型，Hap2為吉林吉安種群與遼寧岫巖種群共享單倍型。單倍型和變異位點如表1所示。圖2(A)是依據單倍型間核苷酸差異構建的網絡關系圖，可以看出東北粗皮蛙線粒體控制區序列8個單倍型沒有形成分支結構，各單倍型間僅有1～3步突變。

表1 東北粗皮蛙線粒體DNA控制區變異位點分布

圖2 線粒體DNA控制區序列(A)和Cytb基因(B)單倍型網絡關系圖

2.2 線粒體Cytb基因堿基組成和變異位點

東北粗皮蛙線粒體Cytb基因PCR擴增后得到長度為895bp的片段，序列經Blast同源性比對分析確定為東北粗皮蛙線粒體Cytb基因部分片段。在該片段中，A、T、G與C四種核苷酸的平均含量分別為23.6%、28.2%、14.0%和34.2%，A和T的含量為53.8%，略高于G和C的含量。在29個樣本序列中發現8個變異位點，共定義7個單倍型，單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數分別為0.418、0.001、0.667。其中Hap1為9個地理種群共享單倍型，Hap7為吉林吉安種群與遼寧莊河種群共享單倍型。單倍型和變異位點如表2所示。圖2(B)是Cytb基因片段單倍型網絡關系圖。各單倍型間核苷酸突變步驟在1～5之間，Hap2與Hap3間最多。

表2 東北粗皮蛙線粒體Cytb基因變異位點分布

2.3 線粒體DNA序列合并數據分析

將所測線粒體控制區和Cytb基因序列合并得到長度為1482bp序列。合并序列共定義14個單倍型，單倍型多樣性0.704，核苷酸多樣性0.001，平均核苷酸差異數為1.438。基于Kimura雙參數模型的單倍型間的遺傳距離在0.000～0.005之間，平均為0.001，對定義的9個種群分析，種群間遺傳距離為0.000～0.002。分子變異分析(AMOVA)結果(表3)，種群內變異占全部遺傳變異的98.13%，也就是說，遺傳變異幾乎全部來源于群體內個體間，群體間沒有遺傳分化。遺傳分化指數FST為0.0187(P＞0.05)。

表3 基于線粒體DNA合并數據對東北粗皮蛙的AMOVA分析

3 討論

本研究通過線粒體控制區和Cytb基因序列分析，探討了9個東北粗皮蛙種群的遺傳多樣性和種群遺傳結構。從各項遺傳參數可以看出，東北粗皮蛙種群的遺傳多樣性很低，種群間無遺傳分化。

東北粗皮蛙在中國主要分布于東北東部山區，通過野外實地調查研究發現，在長白山及其南部山地丘陵較為常見，且種群數量也相對較多。國外主要分布在朝鮮半島及俄羅斯遠東邊疆區。韓國學者Lee et al.(1999)［20］利用線粒體Cytb基因對東北粗皮蛙種群遺傳學研究發現，韓國東北粗皮蛙可以分成2個分離的支系(A和B)，A貫穿于整個韓國地域，B則集中于韓國東南的中部地區，而在韓國Tonghae種群中2個支系類型都有發現。A支系的6個種群Cytb序列差異為0～0.8%，B支系的4個種群為0～1.0%，但2個支系間的序列差異則達到5.4～6.6%，基于Kimura雙參數的A與B支系遺傳距離是6.7%。Yang et al.［27］利用淀粉凝膠電泳方法分析了東北粗皮蛙的17個等位酶和蛋白質，結果認為韓國種群的遺傳分化程度適中。本研究中，線粒體控制區和Cytb基因合并序列分析，核苷酸多樣性僅為0.001，平均核苷酸差異數為1.438，9個種群間的遺傳距離為0～0.2%，低于韓國2個支系內種群間的變異水平。分子變異分析結果，東北粗皮蛙種群遺傳變異幾乎全部來源于群體內個體間，群體間沒有遺傳分化(FST=0.01868)，明顯低于韓國種群。在其他蛙科物種的研究中［28－30］也有類似的結果。

本研究所采集東北粗皮蛙樣本均來自長白山南部山地丘陵及其余脈——千山山地，這些地區地形地貌相近，同屬東北東部山地針闊葉混交林亞區域，河流密布貫通且少有高山分割。東北粗皮蛙生活在河流水域附近，受精卵、蝌蚪及成體借河水溪流遷移，這可能是造成中國分部東北粗皮蛙遺傳多樣性低、種群間無遺傳分化的主要原因。

動物的遺傳多樣性體現在群體、個體、組織、細胞以及分子水平。在自然界，由于個體生命的有限性，其特定分布格局的群體才是進化的基本單位。因而，遺傳多樣性不僅包括遺傳變異高低，也包括遺傳變異在群體間的分布格局，即種群遺傳結構。一個物種的進化潛力和抵御不良環境的能力取決于種內遺傳變異的大小，更有賴于群體遺傳結構［31］。東北粗皮蛙在中國僅分布于東北地區東部長白山脈區域，已被列入《國家保護的有益的或有重要經濟、科研價值的陸生野生動物名錄》種類。本研究表明，東北粗皮蛙的遺傳多樣性低，種群間無遺傳分化。鑒于此，對東北粗皮蛙野生種群的保護應當引起足夠重視，特別是對其食物、水及隱蔽所等棲息地環境的保護，同時，在遺傳、生態以及保護生物學等領域開展深入的研究。

4 結論

(1)東北粗皮蛙種群遺傳多樣性低，種群間無遺傳結構。

(2)應加強對東北粗皮蛙野生種群的保護。

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