不同劑量瑞舒伐他汀對實驗性動脈粥樣硬化大鼠過氧化及血管平滑肌增生的影響

劉愛寧，楊文剛，鞠樹紅，聶丹鳳，周 暉

(1.上海市普陀區利群醫院神經內科，上海200333;2.第二軍醫大學附屬長征醫院神經內科，上海200003)

不同劑量瑞舒伐他汀對實驗性動脈粥樣硬化大鼠過氧化及血管平滑肌增生的影響

劉愛寧1，楊文剛1，鞠樹紅1，聶丹鳳1，周 暉2*

(1.上海市普陀區利群醫院神經內科，上海200333;2.第二軍醫大學附屬長征醫院神經內科，上海200003)

目的觀察不同劑量瑞舒伐他汀對動脈粥樣硬化大鼠過氧化及血管平滑肌增生的影響。方法 將46只大鼠隨機分為5組。對照組(n=6)給予普通飼料喂養;高蛋氨酸組(n=10)在此基礎上加質量分數2%的蛋氨酸;葉酸組(n=10)在高蛋氨酸飼料喂養4周后，葉酸按每天0.8 mg/kg劑量灌胃;瑞舒伐他汀低劑量組(n=10)和高劑量組(n=10)以高蛋氨酸飼料喂養4周后，瑞舒伐他汀分別按每天1、2 mg/kg劑量灌胃。末次灌胃后4 h處死動物取血及頸主動脈。檢測各組大鼠血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)、血漿丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)活性及炎癥因子表達，測量頸動脈內膜中膜厚度。結果建模后12周，各組血漿Hcy水平均較建模前顯著升高，依次為高蛋氨酸組＞葉酸組＞低劑量組＞高劑量組＞對照組(P＜0.05);瑞舒伐他汀組各過氧化、炎癥指標均顯著優于高蛋氨酸組，高劑量組MDA、腫瘤壞死因子α、白細胞介素8及基質金屬蛋白酶9含量較低劑量組降低，GSH-PX活性則明顯增強(P＜0.05);高蛋氨酸組、葉酸組與低劑量組頸動脈內膜中膜厚度明顯高于對照組、高劑量組(P＜0.05)。結論高劑量瑞舒伐他汀對高Hcy性動脈粥樣硬化的療效更佳，可達到更好的過氧化抑制作用，降低動脈血管平滑肌厚度。

動脈硬化;瑞舒伐他汀;肌，平滑

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種復雜的慢性炎癥性疾病，高同型半胱氨酸(hyperhomocysteinemia，HHcy)是近年新確認的AS性心腦血管疾病的獨立危險因素，但其導致AS的機制仍未十分清楚［1-2］。瑞舒伐他汀是目前臨床上治療及預防AS的一線用藥，具有抗炎、改善內皮功能、穩定斑塊等作用，能減輕AS患者的病情和臨床結局［3］，但關于瑞舒伐他汀對AS的劑量選擇及量效關系一直是爭議的焦點。本研究通過蛋氨酸飼養大鼠制備實驗性AS動物模型，分析瑞舒伐他汀對同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)致AS的療效，以及其濃度水平與過氧化反應及血管平滑肌增生的關系，旨在為AS預防和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 健康8周齡的SD雄性大鼠46只，體質量200～250 g，平均(228.1± 12.3)g，由長征醫院實驗動物中心提供。蛋氨酸購于上海生工生物工程有限公司，瑞舒伐他汀鈣片(Rosuvastatin Calcium，商品名:可定)由英國阿斯利康公司提供。

1.2 實驗分組與動物模型的建立 將46只大鼠隨機分為對照組、葉酸組、高蛋氨酸組、瑞舒伐他汀低劑量組和高劑量組。其中對照組(n=6)給予普通飼料喂養;高蛋氨酸組(n=10)在普通飼料喂養的基礎上加質量分數2%的蛋氨酸;葉酸組(n=10)在高蛋氨酸飼料喂養4周后，葉酸按每天0.8 mg/kg劑量灌胃，同時持續高蛋氨酸飲食;低劑量組(n=10)以高蛋氨酸飼料喂養4周后，瑞舒伐他汀按每天1 mg/kg劑量灌胃，同時持續高蛋氨酸飲食;高劑量組(n=10)以高蛋氨酸飼料喂養4周后，瑞舒伐他汀按每天2 mg/kg劑量灌胃，同時持續高蛋氨酸飲食。實驗動物操作過程遵照醫院動物倫理委員會規程進行。

1.3 檢測指標

1.3.1 Hcy及過氧化、炎癥指標測定 在末次灌胃后4 h處死大鼠取血，采血后置于含2%乙二胺四乙酸二鈉100μL試管中，3 000 r/min離心10 min后分離血清置于-70℃冰箱保存待檢。采用高效液相色譜法測定血漿Hcy濃度，采用比色法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)，采用酶聯免疫吸附測定法測定腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)、白細胞介素8(interleukin 8，IL-8)，采用免疫組織化學染色測定基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP-9)，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 頸動脈內膜中膜厚度測定 快速切開頸部，取出左頸總動脈約2 cm，冰凍切片，HE染色處理，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定內膜中膜厚度，不同部位測5次取平均值。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析及q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組建模前后血漿Hcy水平變化 建模前，各組血漿Hcy水平比較，差異無統計學意義(P＞0.05);建模后12周，各組血漿Hcy水平均較建模前顯著升高，依次為高蛋氨酸組＞葉酸組＞低劑量組＞高劑量組＞對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組建模前后血漿Hcy水平變化Table 1 Plasm a H cy change before and after modeling among different groups (±s，μmol/L)

表1 各組建模前后血漿Hcy水平變化Table 1 Plasm a H cy change before and after modeling among different groups (±s，μmol/L)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.05與高蛋氨酸組比較 △P＜0.05與葉酸組比較 ☆P＜0.05與低劑量組比較(q檢驗)

Hcy建模前 建模后對照組組別 n6 6.75±1.13 7.22±1.27高蛋氨酸組 10 6.84±1.05 107.95±21.35*葉酸組 10 6.58±1.09 97.25±35.35*#低劑量組 10 6.68±1.03 85.11±31.64*#△高劑量組 10 6.12±1.02 73.72±24.73*#△☆F＞0.05 ＜0.05 0.680 14.830P

2.2 各組血漿過氧化、炎癥指標比較 與對照組比較，高蛋氨酸組、葉酸組、低劑量組MDA及炎癥指標明顯升高，GSH-PX明顯下降，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而高劑量組與對照組之間MDA差異無統計學意義(P＞0.05)。低劑量組和高劑量組各過氧化、炎癥指標均顯著優于較高蛋氨酸組及葉酸組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且高劑量組MDA、TNF-α、IL-8及MMP-9含量較低劑量組降低，GSH-PX活性則明顯增強，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組血漿過氧化、炎癥指標比較Table 2 Comparison of plasma peroxide and inflammatory indicators among different groups (±s)

表2 各組血漿過氧化、炎癥指標比較Table 2 Comparison of plasma peroxide and inflammatory indicators among different groups (±s)

*P＜0.05與對照組比較#P＜0.05與高蛋氨酸組比較△P＜0.05與葉酸組比較☆P＜0.05與低劑量組比較(q檢驗)

組別 n MDA(μmol/L) GSH-PX(μmol/L) TNF-α(ng/L) IL-8(ng/L) MMP-9(ng/L)對照組 6 5.71±0.83 82.41±11.17 101.50±24.12 45.71±4.63 160.37±15.31高蛋氨酸組 10 13.51±1.72* 45.39±7.44* 457.80±176.01* 91.40±15.31* 310.15±25.70*葉酸組 10 12.48±1.28* 50.72±8.21*# 308.50±145.81*# 84.75±10.87*# 279.21±21.82*#低劑量組 10 9.16±1.17*#△ 62.17±10.76*#△ 277.90±110.46*#△ 76.13±9.24*#△ 221.23±19.46*#△高劑量組 10 6.19±0.96#△☆ 71.59±12.42#△☆ 178.70±75.56*#△☆ 63.51±6.32*#△☆ 191.15±18.37*#△☆F＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 5.621 9.032 12.910 5.983 13.864P

2.3 各組頸動脈內膜中膜厚度比較 高蛋氨酸組、葉酸組、低劑量組頸動脈內膜中膜厚度明顯高于對照組、高劑量組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而高蛋氨酸組、葉酸組與低劑量組之間兩兩比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 各組頸動脈內膜中膜厚度比較Table 3 Comparison of carotid intimal thickness among different groups (±s，mm)

表3 各組頸動脈內膜中膜厚度比較Table 3 Comparison of carotid intimal thickness among different groups (±s，mm)

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.05與高蛋氨酸組比較 △P＜0.05與葉酸組比較 ☆P＜0.05與低劑量組比較(q檢驗)

頸動脈內膜中膜厚度對照組組別 n7.35±0.67高蛋氨酸組 10 10.74±1.05*葉酸組 10 9.21±1.31*低劑量組 10 9.62±1.74*高劑量組 10 7.86±1.08#△☆F6＜0.05 5.160P

3 討 論

AS的發病機制極為復雜，涉及炎癥、氧化應激、血管平滑肌異常增生、免疫因素等諸多因素，其中血管內皮細胞的炎性損傷和過氧化與血管平滑肌細胞增殖的關系尤為密切［4-5］。HHcy已被確立為AS的獨立危險因素，但如何使用藥物干預逆轉HHcy性AS尚不清楚。據研究統計，約40%的心腦血管病患者血漿Hcy濃度不同程度的升高，且每升高5μmol/L，心腦血管病的死亡風險增加30%～40%［6］。臨床上對HHcy性AS的防治多采用葉酸及維生素進行非特異性治療，療效尚無法確定。

瑞舒伐他汀作為迄今為止最強的降脂藥物，現已廣泛應用于治療致AS的血脂紊亂，同時還具有穩定斑塊、抗炎、抗氧化等非調脂作用［7］。但對于瑞舒伐他汀能否抑制頸動脈新生內膜增生以及其治療的最適劑量仍存在爭議。本研究給予雄性SD大鼠蛋氨酸灌胃的方式構建HHcy性AS大鼠模型，結果顯示，建模后12周，各組血漿Hcy水平均較建模前顯著升高，依次為高蛋氨酸組＞葉酸組＞低劑量組＞高劑量組＞對照組(P＜0.05)，且瑞舒伐他汀組各過氧化、炎癥指標均顯著優于較高蛋氨酸組、葉酸組，高劑量組MDA、TNF-α、IL-8及MMP-9含量較低劑量組降低，GSH-PX活性則明顯增強。一方面驗證了Hcy參與AS的氧化應激反應，促進了AS的形成;另一方面說明瑞舒伐他汀較葉酸能更好地減弱Hcy對GSH-PX活性的抑制作用，加強氧化保護機制，抑制炎癥反應，且其效應呈劑量相關性［8］。

有研究認為，血管內皮的損傷會對血管平滑肌細胞的可塑性造成影響，使其去分化為增殖型表型［9］。于海嬌等［10］研究也發現，Hcy可以直接促進血管平滑肌細胞內膜下增殖，在AS的發病中有極其重要的地位。本研究中，高蛋氨酸組、葉酸組、低劑量組頸動脈內膜中膜厚度明顯高于對照組、高劑量組(P＜0.05)。說明瑞舒伐他汀對上述表型的轉變具有抑制作用，抑制血管平滑肌異常增殖，且劑量越高，效果越明顯。最新研究發現，MAPK信號通路與細胞增殖和遷移過程有關，而瑞舒伐他汀可能參與下調該信號通路的活性［11］。

綜上所述，高劑量瑞舒伐他汀對HHcy性AS的療效更佳，可達到更好的過氧化抑制作用，降低頸動脈血管平滑肌厚度的效果更好，但其具體的作用機制尚待于進一步研究。

［1］Ghassibe-Sabbagh M，Platt DE，Youhanna S，et al.Genetic and environmental influences on total plasma homocysteine and its role in coronary artery disease risk［J］.Atherosclerosis，2012，222 (1):180-186.

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［3］馬曉峰，高琴，邊惠萍，等.瑞舒伐他汀對經皮冠狀動脈介入治療患者術后炎癥反應與心肌損傷的影響［J］.臨床薈萃，2013，28(9):1042-1044.

［4］駱瑩瑩，姚樹桐，王大新，等.氧化應激在動脈粥樣硬化發生發展中作用的研究新進展［J］.中國介入心臟病學雜志，2013，21(1):46-50.

［5］朱玉林，米立國，郝連軍，等.錳-超氧化物歧化酶、過氧化氫酶在異丙腎上腺素所致大鼠心肌肥厚中的表達［J］.河北醫科大學學報，2014，35(2):1042-1044.

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［7］鄒克勇.瑞舒伐他汀應用研究進展［J］.醫學信息，2013，30 (8):707-708.

［8］李燕，張春來，盧峰，等.高同型半胱氨酸血癥對平滑肌細胞的氧化損傷［J］.首都醫科大學學報，2012，33(2):251-254.

［9］李平，甘劍挺，王正東，等.瑞舒伐他汀抑制血小板衍生生長因子誘導的血管平滑肌細胞的增殖和遷移［J］.暨南大學學報:自然科學與醫學版，2013，34(6):588-592.

［10］于海嬌，徐支芳，馬琳娜，等.同型半胱氨酸對血管平滑肌細胞增殖和細胞周期的影響及葉酸的拮抗作用［J］.寧夏醫科大學學報，2012，34(1):7-9.

［11］Yang JL，Lin JH，Weng SW，et al.Crude extract of Euphorbia for mosana inhibits the migration and invasion of DU145 human prostate cancer cells:The role of matrix metalloproteinase-2/9 inhibition via the MAPK signaling pathway［J］.Mol Med Rep，2013，7(5):1403-1408.

(本文編輯:劉斯靜)

Influence of different doses rosuvastatin on peroxidation and proliferation of vascular smooth muscle cells for experimental atheriosclerosis rats

LIU Ai-ning1，YANG Wen-gang1，JU Shu-hong1，NIE Dan-feng1，ZHOU Hui2*
( 1． Department of Neurology，Putuo District Liqun Hospital of Shanghai，Shanghai 200333，China; 2． Department of Neurology，the Affiliated Changzheng Hospital of the Second Military Medical University of PLA，Shanghai 200003，China)

Objective To explore the influence of different doses rosuvastatin on peroxidation and proliferation of vascular smooth muscle cells for experimental atheriosclerosis rats.MethodsForty-six male rats were divided randomly into five groups，control group(n=6)was given with ordinary feed，high methionine group(n=10)with 2% methionine on this basis，folic acid group(n=10)with high methionine feed after four weeks，adding folic acid for lavage by 0.8 mg/kg per day，low dose group(n= 10)and high dose group(n=10)with high methionine feed after four weeks，adding rosuvastatin for lavage by 1 mg/kg per day，2 mg/kg per day，respectively.The rats were executed after last lavage for four hours to get blood and carotid artery.Plasma homocysteine(Hcy)，content of plasma malondialdehyde (MDA)，activity of glutathione peroxidase(GSH-PX)and inflammatory factors were detected，and the relative thickness of carotid artery walls was measured.ResultsAt12 weeks after modeling，the level ofplasma Hcy was significantly increased than before modeling，the order was high methionine group＜folic acid＜low dose group＜high dose group＜control group(P＜0.05).The peroxide and inflammatory indexes in rosuvastatin group were significantly better than those of high methionine group.Compared with low dose group，content of MDA，tumor necrosis factor-α，interleukin 8 and matrix metalloproteinases 9 decreased，the activity of GSH-PX was significantly enhanced in high dose group(P＜0.05).The relative thickness of carotid artery walls in high methionine，folic acid group and low dose group was obviously higher than that of control group，high dose group(P＜0.05).ConclusionHigh dose of rosuvastatin has better effect of atherosclerosis caused by hyperhomocysteinemia，and can achieve better inhibitory effect on peroxide，decrease the thickness of artery vascular smooth muscle more remarkably.

arteriosclerosis;rosuvastatin;muscle，smooth

R543.5

A

1007-3205(2015)02-0133-04

2014-06-19;

2014-08-23

上海市普陀區衛生系統自主創新科技資助項目(KW-2012-02)

劉愛寧(1972-)，女，山東煙臺人，上海市普陀區利群醫院副主任醫師，醫學碩士，從事腦血管疾病診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.004