黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌對18種抗生素的耐藥性分析

郭嘉紅，王文生，周敬華，閆東輝

(1.河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院檢驗科，河北大廠065300;2.河北省三河市醫(yī)院檢驗科，河北三河065200; 3.河北省永清縣人民醫(yī)院檢驗科，河北永清065600;4.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院檢驗科，北京100050)

黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌對18種抗生素的耐藥性分析

郭嘉紅1，王文生2，周敬華3，閆東輝4

(1.河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院檢驗科，河北大廠065300;2.河北省三河市醫(yī)院檢驗科，河北三河065200; 3.河北省永清縣人民醫(yī)院檢驗科，河北永清065600;4.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院檢驗科，北京100050)

目的比較黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)在體外藥物敏感性試驗中對各種藥物的耐藥性，指導臨床合理使用抗菌藥物。方法 使用生物梅里埃API20NE系統(tǒng)對菌株進行鑒定，用K-B紙片法和微量肉湯稀釋法對菌株進行藥物敏感性試驗，并進行統(tǒng)計學分析。結果黏液型PA對黏菌素、阿米卡星、妥布霉素100.0%敏感，其余抗菌藥物的耐藥率為2.6%～78.3%;非黏液型PA對復方新諾明100.0%耐藥，其余抗菌藥物的耐藥率為2.6%～96.6%。除黏菌素、阿米卡星外，黏液型PA耐藥率均顯著低于非黏液型PA(P＜0.05或＜0.01)。結論黏液型PA的體外耐藥性明顯弱于非黏液型PA，但由于其能產(chǎn)生大量藻酸鹽，而在菌體外形成生物膜，因此要加強非黏液型PA的檢測，指導臨床合理用藥。

銅綠假單胞菌;抗生素類;抗藥性，細菌

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是非發(fā)酵菌之一，為條件致病菌，廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境，其易定植、易變異以及多重耐藥性的特征，已成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌之一［1］。它是院內(nèi)呼吸道感染的首要病因，在重癥監(jiān)護病房特殊護理的插管患者中尤為嚴重，病死率在40%～50%。PA可導致院內(nèi)泌尿道感染、傷口感染、慢性活動性腹膜炎透析患者腹膜炎和菌血癥。PA還是兒童和成人艾滋病患者發(fā)病和死亡的重要原因。PA從菌落形態(tài)可分為黏液型和非黏液型。黏液型PA由于大量產(chǎn)生藻酸鹽而在菌體外形成生物被膜，該被膜能使菌體逃逸機體免疫清除和增強對抗菌藥物的耐藥，一旦感染很難從患者體內(nèi)清除，是造成肺囊性纖維化的重要病原菌［2］。本研究對臨床分離的黏液型PA和非黏液型PA進行鑒定及藥敏分析，旨在了解黏液型和非黏液型PA的耐藥特征，以便為臨床更有效、更合理地使用抗菌藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2010年9月—2013年9月河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院臨床送檢的各類標本分離出的PA 383株，其中黏液型PA 115株，非黏液型PA 268株。同一患者相同部位重復分離到的相同菌株不作重復計數(shù)。

1.2 質(zhì)控菌株 PA ATCC27853，大腸埃希菌ATCC25922。

1.3 試劑 法國梅里埃API20NE鑒定卡，藥物敏感性紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品，抗菌藥物粉劑購自SigmaAldrich公司，M-H培養(yǎng)基購自天津金章公司。

1.4 細菌鑒定與藥敏試驗 標本送至微生物實驗室后，按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》［3］相應要求接種、分離，獲得單個菌落后，經(jīng)法國梅里埃API20NE鑒定為PA，其菌落形態(tài)在麥康凱培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18～24 h，生長為無色、小露滴樣、邊緣不規(guī)則小菌落，48～72 h長大而融合、黏稠、膠凍樣，用接種環(huán)不易挑起的無金屬光澤、無特殊氣味的菌落為黏液型PA。非黏液型PA菌落呈灰綠色，大小不一，扁平濕潤，邊緣不規(guī)則，呈傘狀伸展，有金屬光澤。采用微量肉湯稀釋法和K-B紙片擴散法進行藥敏試驗［4］。用K-B紙片擴散法對黏液型PA進行藥敏試驗時應延長孵育時間至48 h。結果判定按2010年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準進行解釋。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用細菌耐藥監(jiān)測軟件WHONET 5.6進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，組間耐藥性比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 鑒定結果 268株非黏液型PA中，來自痰標本檢出率最高221株(82.5%)，來自膿液及分泌物31株(11.6%)，來自咽拭子8株(3.0%)，來自尿液6株(2.2%)，來自血液2株(0.7%)。115株黏液型PA中，來源于痰液109株(94.8%)，來源于膿液及分泌物4株(3.5%)，來源于其他2株(1.7%)。

2.2 藥敏結果 268株非黏液型PA對黏菌素、阿米卡星耐藥性較低，分別為2.6%、3.0%，對妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、美洛培南、亞胺培南、氨曲南耐藥率為10.1%～52.2%，對頭孢曲松、呋喃妥因、頭孢呋辛、頭孢唑林、復方新諾明耐藥率為90.7%～100.0%。115株黏液型PA對黏菌素、阿米卡星、妥布霉素、美洛培南藥率為0.0%。對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、亞胺培南耐藥率也很低為2.6%～10.4%，對頭孢曲松、呋喃妥因、頭孢呋辛、頭孢唑林、復方新諾明耐藥率為37.4%～78.3%。除黏菌素、阿米卡星外，非黏液型PA對各種藥物的耐藥率明顯均高于黏液型PA，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或＜0.01)。見表1。

表1 黏液型與非黏液型PA對18種抗生素耐藥率的比較(株數(shù)，%)

3 討 論

PA是引起彌漫性泛細支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管擴張并感染的重要病原菌之一［5］。本研究中268株非黏液型PA中，來自痰標本221株(82.5%)，115株黏液型PA中，來源于痰液109株(94.8%)，與相關文獻基本一致［6］。

本研究非黏液型PA對抗生素耐藥性較高，其對黏菌素、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素耐藥性較低分別為2.6%、3.0%、10.1%、11.2%、15.3%、16.8%，與朱荔清等［7］的研究結果基本一致。黏菌素與細菌細胞膜的磷脂發(fā)生作用，增加細胞的通透性并破壞滲透完整性，引起細胞內(nèi)成分流失，導致細胞死亡。黏菌素僅作用于革蘭陰性桿菌，特別是假單胞菌屬細菌，治療期間很少出現(xiàn)耐藥性，與其他抗生素無交叉耐藥。黏菌素與復方新諾明聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，治療多重耐藥假單胞菌屬引起的感染。黏菌素通常作為嚴重的、威脅生命的假單胞菌感染或?qū)λ锌股啬退幉≡w引起的革蘭陰性菌感染的后備藥物，氣溶性多黏菌素已成功地治療了肺囊性纖維化或支氣管擴張癥患者PA定植或呼吸系統(tǒng)感染。但在臨床應用中應注意其不能穿透膜進入胸水、滑液或腦脊液，以及它的神經(jīng)毒性和腎毒性的不良反應。非黏液型PA對阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、氨基糖苷類抗生素耐藥性也較低，為3.0%、10.1%、16.8%。氨基糖苷類抗生素的主要特點是它們對需氧革蘭陰性桿菌(包括PA)具有殺菌活性，其通過不可逆結合到細菌30s核糖體亞單位，抑制細菌蛋白合成，在蛋白合成期，氨基糖苷類-細菌核糖體結合物形成，使mRNA轉移障礙，導致細胞死亡。雖然慶大霉素和妥布霉素有非常相似的抗菌活性譜，而妥布霉素對PA的抗菌活性更強。慶大霉素和妥布霉素容易被耐藥菌產(chǎn)生的同一種修飾酶滅活，因此容易產(chǎn)生交叉耐藥。阿米卡星對多數(shù)氨基糖苷類修飾酶有抗性，所以常用作慶大霉素和妥布霉素耐藥性流行時的選擇品種。阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素可作為首選的治療PA感染推薦藥物，但因它們的腎臟毒性、聽力或前庭毒性，臨床應用受到了局限。非黏液型PA對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、哌拉西、耐藥率分別為11.2%、15.3%、17.9%，它們也可作為治療PA感染的臨床常用藥物。左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶耐藥率分別為19.4%、22.4%、24.6%，這些抗生素對PA具有較強的抗菌作用，但隨著它們在臨床大量、廣泛的應用，其耐藥性也在逐年增加。氨曲南耐藥率為52.2%，它與氨基糖苷類具有體外協(xié)同抗菌作用，作為單環(huán)類抗生素細菌耐受和接種物效應較少見，臨床聯(lián)合用藥效果較好。美洛培南、亞胺培南的耐藥率為22.4%、25.0%，與蔣冬香等［8］的研究結果相似。碳青酶烯類抗生素是針對革蘭陰性桿菌感染療效較為可靠且穩(wěn)定的藥物。近年來，由于它們廣泛應用于治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶革蘭陰性桿菌引起的感染，在抗菌藥物選擇性壓力下，使其對PA的敏感性逐年下降，耐碳青酶烯類抗生素開始出現(xiàn)，并逐年增多。細菌耐藥性來源于產(chǎn)生了能水解碳青霉烯核的碳青酶烯酶和細菌細胞壁孔道蛋白通道的改變。其同廣譜頭孢菌素或超廣譜青霉素聯(lián)合應用時，亞胺培南可以表現(xiàn)出體外抗拮作用，其結果是它能誘導Ⅰ組β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生。因此，臨床用藥時避免亞胺培南與上述藥物聯(lián)合應用，以免引起PA產(chǎn)生耐藥性。頭孢曲松、呋喃妥因、頭孢呋辛、頭孢唑林、復方新諾明耐藥率為90.7%～100.0%，它們對 PA天然耐藥［9］。因此，要加強細菌培養(yǎng)與鑒定工作，及時找出病原菌，合理應用抗生素。

黏液型PA是PA自然存在的一種特殊形式，其在細菌表面產(chǎn)生大量黏液，主要成分為多糖藻，從而可以持續(xù)定植、形成生物膜。一旦PA形成生物膜，有助于細菌逃逸抗菌藥物或宿主防御機制，引起感染持續(xù)存在、抗菌藥物治療效果不明顯等［10］。非黏液型PA在滲透壓較高、氯化鈉較多、磷酸鹽較少等環(huán)境條件下容易轉化為黏液型PA［11］。體外藥敏試驗中，非黏液型PA對抗菌藥物的耐藥率明顯高于黏液型PA。這主要是因為體外藥敏試驗只測試浮游狀態(tài)的細菌，不能反映生物膜介導的耐藥性，常出現(xiàn)黏液型PA雖然體外藥敏試驗敏感，但臨床體內(nèi)用藥大多無效，造成實驗室檢測和臨床治療效果之間的矛盾［12］。這是因為細菌生物被膜可阻礙營養(yǎng)物質(zhì)透過，細菌代謝低下，且抗菌藥物不易通過被膜，因而產(chǎn)生耐藥性，即使抗菌藥物濃度達到很高，仍不能殺滅被膜下的細菌。細菌生物被膜還能夠避免細菌與免疫細胞及抗體相互作用，抑制吞噬細胞吞噬，產(chǎn)生免疫逃逸，從而使其長期生存。藻酸鹽是黏液型PA形成生物被膜的主要成分。體外研究發(fā)現(xiàn)，藻酸鹽在黏液型PA生物被膜的形成中發(fā)揮著重要的作用，故除去生物被膜必須設法減少藻酸鹽的合成。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能起到有效抵抗生物被膜的作用。體內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能使生物膜的表面形成孔穴，從而使生物膜內(nèi)部細菌得以暴露，有利于敏感藥物進入生物膜內(nèi)部殺滅細菌。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可使體內(nèi)藻酸鹽免疫復合物逐漸下降，有效地抑制由藻酸鹽介導的抗原抗體反應;大環(huán)內(nèi)酯類抗生素尚有免疫調(diào)節(jié)作用，能有效地增強中性粒細胞對PA生物膜的吞噬作用［13］。本研究顯示，黏液型PA體外敏感的抗菌藥物較多，除黏菌素、阿米卡星(P＞0.05)外，對其他藥物的耐藥性明顯低于非黏液型PA，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或＜0.05)。黏菌素、阿米卡星對黏液型和非黏液型PA的耐藥性差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)且耐藥性較低，可以作為臨床經(jīng)驗性用藥的首選藥物。妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、哌拉西林、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、美洛培南、亞胺培南對黏液型PA耐藥率也很低，與非黏液型PA的耐藥性差異有統(tǒng)計學意義。但在治療黏液型PA引起感染時，還必須考慮其存在生物被膜耐藥的因素，在臨床使用中應與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素聯(lián)合應用從而達到殺菌的目的。在肺囊性纖維化患者肺部感染的晚期，PA可能表現(xiàn)出對所有的抗生素耐藥，大劑量的妥布霉素霧化治療可能有效。體外藥敏試驗有13.9%～17.4%的黏液型PA株對頭孢曲松、呋喃妥因、頭孢呋辛、頭孢唑林、復方新諾明敏感，可能與這些菌株的基因發(fā)生了突變，也可能與在體外試驗中由于黏液型PA的菌落表面覆蓋一層厚厚的黏液，致使制作菌液的過程中挑取了大量的黏液而導致實際的菌液濃度偏低有關。但由于PA對上述藥物天然耐藥，因此在治療時應首先排除此類藥物。

總之，通過對黏液型和非黏液型PA耐藥性的分析，了解它們的耐藥特點，可指導臨床正確選擇合理的抗生素進行治療，防止耐藥菌的產(chǎn)生。

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(本文編輯:許卓文)

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1007-3205(2015)02-0217-04

2014-05-26;

2014-07-13

郭嘉紅(1971-)，男，河北大廠人，河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院副主任檢驗師，從事臨床微生物檢驗學研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.036