右美托咪啶對脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞Toll樣受體4表達的影響

韓 彬，趙俊鶯，何愛萍，舒 雅

（西安醫學院第一附屬醫院麻醉科，陜西西安710077）

右美托咪啶對脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞Toll樣受體4表達的影響

韓 彬，趙俊鶯，何愛萍，舒 雅*

（西安醫學院第一附屬醫院麻醉科，陜西西安710077）

目的觀察右美托咪啶對脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）表達的影響，并探討其可能的機制。方法 購買大鼠腎小管上皮細胞，經復蘇、培養，均加入10μg／L脂多糖，均經培養后分為3組。A組為空白對照組；B組為陽性對照組，加入右美托咪啶2.5μg；C組作為實驗組，先加入阿替美唑10μg，30 min后加入右美托咪啶2.5μg。繼續培養12 h。采取免疫組織化學法檢測3組細胞TLR4表達及TLR4m RNA水平，并測定3組細胞凋亡率。結果B組應用右美托咪啶后，TLR4、TLR4m RNA和細胞凋亡率均低于A組（P＜0.01）；C組TLR4、TLR4m RNA和細胞凋亡率均高于B組（P＜0.01）。結論右美托咪啶可下調脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達，且右美托咪啶對TLR4的調節與α2腎上腺素能受體被激動相關。

右美托咪啶；脂多糖類；腎小管上皮細胞

膿毒癥患者臨床并不少見，患者病情危重，多數入住重癥監護病房（intensive care unit，ICU）進行治療［1］。膿毒癥患者急性腎損傷發生率較高，為重要并發癥之一，是患者死亡的重要危險因素，嚴重者威脅患者的生命安全。右美托咪啶為近年臨床應用廣泛的α2腎上腺素能受體（α2adrenogic recptor，α2AR）激動劑，其可激動機體中樞神經系統的α2AR，發揮鎮靜、催眠作用［2］。相關研究［3－5］表明，右美托咪啶于ICU應用取得較為滿意的鎮靜效果的同時對患者重要器官具有一定保護作用，本研究旨在探討右美托咪啶對于膿毒癥大鼠腎小管上皮細胞Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）表達的影響，以評估其對腎臟的保護作用，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 大鼠腎小管上皮細胞由西安醫學院附屬醫院中心實驗室提供；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，批號L2880，購于天津灝洋生物制品有限公司）；右美托咪啶（批號09081232，購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）；酶聯免疫吸附測定試劑盒（購于北京科美東雅生物技術有限公司；PTPCR試劑（購于大連寶生物工程有限公司）；引物合成（購于傷害生工生物工程技術服務有限公司）；PCR擴增儀（購于美國PE公司）。

1.2 細胞復蘇 研究人員于液氮罐中取出細胞，經復蘇后接種細胞于50 m L玻璃瓶中，于MEM培養基中行常規培養，MEM培養基含10%胎牛血清、100 U／m L青霉＋100 U／m L鏈霉素等。將培養基置入37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養箱，并于每1～2 h更換培養基1次；待細胞長成致密單層后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1×105濃度接種于24孔板中，使細胞貼壁生長18～24 h。再加入LPS（10μg／L）培養12 h。然后隨機分為3組，每組10只。

1.2.1 實驗分組 A組為空白對照組；B組為陽性對照組，加入右美托咪啶2.5μg；C組為實驗組，先加入阿替美唑（α2AR阻滯劑）10μg，30 min后加入右美托咪啶2.5μg。3組均繼續培養12 h。

1.2.2 TLR4及TLR4m RNA水平測定 采用免疫組織化學方式測定3組大鼠腎臟組織TLR4水平。嚴格按照試劑說明進行TLR4m RNA水平測定。TLR4上游引物為5′-GTCCATCGGTTGATCTTGGGA-3′，下游引物為5′-AGAATTGCCAGCCATTTTTAA-3′，擴增片段長度為681 bp。本研究以β-action為內參，其中β-action上游引物為5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′，下游引物為5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAAACC-3′，擴增片段長度為281 bp。PCR反應體系反應條件：94℃環境下變性，時間5min，然后按照94℃30 s、51℃40 s、72℃60 s，行擴增30個循環，最后于72℃下延伸5 min。最后取各組樣本產物5μL，與溴酚藍載樣緩沖液1μL一起加入1.5%瓊脂糖凝聚樣品孔中，于70 V恒壓下電泳20 min，應用DH2000凝膠圖像分析系統進行分析，以TLR4m RNA條帶灰度值與β-action條帶灰度值比值作為TLR4m RNA表達水平。

1.2.3 細胞凋亡檢測 使用PBS洗滌3組細胞，吸取含細胞平衡液100μL至離心管，加入5μL Annexin V-FITC及5μL PI，避光室溫反應15 min，加入400μL平衡液，在流式細胞儀上檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢測。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

3組大鼠腎臟組織TLR4水平及TLR4mRNA水平分析：B組應用右美托咪啶后，TLR4、TLR4m RNA水平和細胞凋亡率均低于A組（P＜0.01）；C組TLR4、TLR4m RNA和細胞凋亡率均高于B組（P＜0.01）；C組TLR4、TLR4mRNA和細胞凋亡率與A組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組大鼠腎臟組織TLR4、TLR4mRNA水平以及細胞凋亡率比較Table 1 TLR4，TLR4mRNA and apoptosis rate in rat kidney tissue of three groups（n＝10，±s）

表1 3組大鼠腎臟組織TLR4、TLR4mRNA水平以及細胞凋亡率比較Table 1 TLR4，TLR4mRNA and apoptosis rate in rat kidney tissue of three groups（n＝10，±s）

*P＜0.01與A組比較 ＃P＜0.01與B組比較（q檢驗）

組別 TLR4（IOD，×103） TLR4m RNA 細胞凋亡率（%）A組 97.52±21.43 0.93±0.05 67.45±11.43 B組 45.13±13.51* 0.46±0.02* 34.62±7.61*C組 87.43±19.40＃ 0.81±0.04＃ 66.22±10.95＃F22.766 397.556 33.682P0.000 0.000 0.000

3 討 論

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）為膿毒血較為常見、嚴重的并發癥之一，AKI主要指由各種原因所致機體腎功能在幾小時至幾天內突然下降而出現的臨床綜合征［6－7］。研究［8］表明，約47.5%膿毒癥患者發生AKI，病死率高達70.2%，腎功能的下降嚴重威脅患者的生命安全。

右美托咪啶為新型高選擇性α2AR激動劑，其機制為通過激動中樞神經系統α2腎上腺素能最密集的區域——腦干藍斑（負責調節覺醒與睡眠），引發并維持自然非動眼睡眠狀態，產生鎮靜、催眠作用。除鎮靜作用外，右美托咪啶還具有鎮痛、穩定血流動力學和利尿的效應。由于其良好的鎮靜和穩定血流動力學作用，右美托咪啶可用于ICU患者的鎮痛，而且有研究［5］表明右美托咪啶對膿毒癥大鼠的腎功能具有一定的保護作用，能改善尿量，降低尿素氨，減少腎衰竭的發生。動物實驗［9－10］表明，膿毒癥時動物血清中的炎性因子明顯升高，右美托咪啶能夠降低膿毒癥大鼠血清腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β和白細胞介素6，提高膿毒癥大鼠的存活率。由于LPS與腎臟TLR4相結合，激活TLR4信號傳導通路，導致IκB從IκB／核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）復合物釋放，NF-κB由此活化轉位進核，使信號下游致炎因子腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β和白細胞介素6分泌增多，導致AKI，已成為學者們的共識。所以，要防治膿毒癥導致的AKI就要靶向性針對TLR4及其信號通路，通過下調TLR4的表達或抑制TLR4信號通路，實現從根源上控制炎性反應對腎臟的損傷。而右美托咪啶可降低膿毒癥大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達，達到腎臟保護作用。本研究結果表明，B組腎小管上皮細胞TLR4表達水平明顯低于A組（P＜0.01），可見右美托咪啶可下調腎小管上皮細胞TLR4表達，發揮腎臟保護作用；而C組應用α2AR阻滯劑后再應用右美托咪啶，TLR4、TLR4m RNA及細胞凋亡均高于B組，可見右美托咪啶下調TLR4表達發揮腎臟保護作用與α2AR被激動有關。

總之，右美托咪啶可降低膿毒癥大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達水平，在取得較佳鎮靜效果的同時保護腎功能，且TRL4下調與α2AR被激動有重要關聯。

［1］ 安友仲.ICU重癥膿毒癥患者的鎮痛鎮靜治療［J］.實用醫院臨床雜志，2012，9（6）：20－22.

［2］ Afonso J，Reis F.Dexmedetomidine：current role in anesthesia and intensive care［J］.Rev Bras Anestesiol，2012，62（1）：118－133.

［3］ Tobias JD，Chrysostomou C.Dexmedetomidine：antiarrhythmic effects in the pediatric cardiac patient［J］.Pediatr Cardiol，2013，34（4）：779－785.

［4］ Hanci V，Yurdakan G，Yurtlu S，et al.Protective effect of dexmedetomidine in a rat model ofα-naphthylthioureainduced acute lung injury［J］.J Surg Res，2012，178（1）：424－430.

［5］ 喬虹，吳新民.右美托咪啶對膿毒癥大鼠腎功能的影響［J］.臨床麻醉學雜志，2009，25（4）：338－340.

［6］ Zarjou A，Agarwal A.Sepsis and acute kidney injury［J］.J Am Soc Nephrol，2011，22（6）：999－1006.

［7］ 李徽徽，汪華學，柴繼俠，等.膿毒癥大鼠腎臟結構和功能的改變及核因子-κB的表達［J］.蚌埠醫學院學報，2013，38（5）：524－527.

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［9］ 崔薇于，泳浩，張曉晨.右美托咪啶對膿毒癥大鼠血清炎性因子和氧化應激反應的影響［J］.中華麻醉學雜志，2011，31（10）：1268－1270.

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（本文編輯：許卓文）

Influence of dexmedetomidine on Toll-like receptor 4 in renal tubular epithelial cells of rat injured by lipopolysaccharide

HAN Bin，ZHAO Jun-ying，HE Ai-ping，SHU Ya*
（Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Xi′an Medical University，Xi′an 710077，China）

ObjectiveTo observe the effect of dexmedetomidine for Toll-like receptor 4（TLR4）in renal tubular epithelial cells on rat injured by lipopolysaccharide（LPS），then to explore the possible mechanism.MethodsRat renal tubular epithelial cells were purchased，recovered，cultured，then added LPS 10μg／L and were cultured and divided into three groups，group A，the blank control group，group B added dexmedetomidine 2.5μg as control group，group C joined atipamezole 10μg and added dexmedetomidine 2.5μg after 30 min as the experimental group，all continued culture for 12 h.Then，immunohistochemistry was used to measure TLR4 protein expression and TLR4mRNA in three groups，and the apoptosis rate of three groups were determined.ResultsAfter using dexmedetomidine，TLR4，TLR4m RNA and apoptotic rate of group B were lower than those of A group（allP＜0.01），while TLR4，TLR4m RNA and apoptosis rate of group C were higher than those of group B（allP＜0.01）.ConclusionDexmedetomidine can downregulate TLR4 expression in renal tubular epithelial cells of the rat injured by LPS，and the regulation for TLR4 of dexmedetomidine is related withα2adrenoglc recptor excited.

dexmedetomidine；lipopolysaccharide；renal tubular epithelial cells

R614

A

1007-3205（2015）01-0042-03

2014－08－22；

2014－10－18

陜西省教育廳專項科研計劃項目（2013JK0795）；西安醫學院第一附屬醫院院級基金項目（XYFY2013-07）

韓彬（1982－），男，陜西西安人，西安醫學院第一附屬醫院主治醫師，醫學碩士，從事臨床麻醉學研究。

*通訊作者

10.3969／ji.ssn.1007-3205.2015.01.016