丹紅對百草枯中毒大鼠肺TGF-β1的影響

韋紅梅,胡利明,郝志強，吳明霞

(1.河北省安國市醫院呼吸科，河北 安國 071200；

2.河北省滄州市渤海新區人民醫院內科，河北 滄州 061113)

·論著·

丹紅對百草枯中毒大鼠肺TGF-β1的影響

韋紅梅1,胡利明1,郝志強1，吳明霞2

(1.河北省安國市醫院呼吸科，河北 安國 071200；

2.河北省滄州市渤海新區人民醫院內科，河北 滄州 061113)

[摘要]目的觀察丹紅注射液對百草枯中毒大鼠肺中轉化生化因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表達的影響，并探討其肺臟保護機制。方法百草枯灌胃染毒造模,觀察肺指數、肺組織病理學變化及形態改變,采用酶聯免疫吸附測定法測定大鼠血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，采用免疫組織化學方法測定肺組織中 TGF-β1的表達。結果單純染毒組和丹紅治療組各時間點血清中TNF-α水平和肺組織中TGF-β1水平均高于空白對照組，丹紅治療組血清中TNF-α水平和肺組織中TGF-β1水平低于單純染毒組，單純染毒組隨時間延長TNF-α和TGF-β1水平逐漸增高，丹紅治療組隨時間延長TNF-α和TGF-β1水平逐漸降低，組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。結論丹紅注射液能通過抑制TGF-β1的合成、降低血清中TNF-α水平，減少細胞外基質異常積聚，對百草枯中毒大鼠肺臟具有保護作用。

[關鍵詞]百草枯；中毒；丹紅；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.021

丹紅注射液是丹參和紅花提取物的中藥制劑。有抗血小板聚集、擴張冠狀動脈、改善微循環、降血脂、抗動脈粥樣硬化、耐缺氧、保護血管內皮、抗細胞凋亡等作用。百草枯是應用比較廣泛的一種除草劑，對人畜均有較強的毒性，能造成機體多臟器的損傷。百草枯損害的主要器官是肺，因其死亡的主要原因是肺損傷引起的呼吸性衰竭。本研究以百草枯灌胃染毒造模,觀察丹紅注射液對百草枯染毒所致大鼠肺病理改變及演變的影響，探討丹紅注射液對肺臟器官的保護作用機制。報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物分組選擇健康清潔的成年SD大鼠(雄性) 72只(購于河北省實驗動物中心)，體質量200~240 g，隨機分為空白對照組8只、單純染毒組32只、丹紅治療組32只。

1.1.1空白對照組生理鹽水1 mL一次性灌胃。

1.1.2單純染毒組百草枯按50 mg/kg用生理鹽水稀釋至1 mL，用其一次性灌胃染毒，染毒后馬上給予生理鹽水(劑量與丹紅注射液量相同，1 mL/kg)腹腔內注射，每天注射1次，直至死亡。

1.1.3丹紅治療組百草枯灌胃染毒(與單純染毒 組量相同)，染毒后馬上給予丹紅注射液1 mL/kg (約0.2 mL) 腹腔注射，每天注射1次，直至死亡。

1.2灌胃染毒百草枯按照50 mg/kg進行計算，用生理鹽水將20%百草枯稀釋至1 mL(新鮮配制)，進行一次性灌胃染毒，操作過程: 用16號長穿刺針外套管，頂端焊成球形，制成灌胃針，用其連接已抽取百草枯溶液注射器，左手抓牢大鼠，用拇指、食指固定下顎，使其頭、頸在一條線上，取垂直位，右手持針，進針深度6~8 cm，若其沒有明顯的掙扎即可進行注射藥物，實驗期間，各組大鼠自由進食、喝水。

1.3標本收集及制備單純染毒、丹紅治療組分別于1、7、14、21 d,各取 8 只大鼠，氯胺酮麻醉后，經股靜脈取血，高速離心后，留取血清備用；用在200 ℃下烤過的器械進行開胸，快速取出部分左肺組織，用刀片將其分成1 mm×1 mm×1 mm大小4~6 塊，置于盛有4% 中性甲醛的小瓶中浸泡固定12 h，制備石蠟切片。對照組8只做同樣處理。

1.4檢測指標及方法

1.4.1酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平測定應用雙抗體夾心ABC-ELISA法。ELISA試劑盒預先包被單克隆抗體，需要檢測的抗體為純化多克隆抗體，將用生物素標記的樣品和抗體以及用氧化物酶標記的親和素，先后加入酶標板孔，反應后，用PBS洗滌，底物3,4,5-三甲氧基苯甲醛(3,4,5-Trimethoxybenzaldehyde，TMB)顯色。用酶標儀450 nm測定(光密度,optical density，OD)值，用標準品和樣品吸光值減去對照孔吸光值所得數據在坐標上畫出曲線，并根據樣品吸光值于坐標上找出對應的濃度。

1.4.2肺組織形態學改變石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察肺組織病變程度。

1.4.3免疫組織化學檢測法將載玻片用APES防脫片處理，然后用石蠟切片進行脫蠟入水，再用3%甲醛-雙氧水消除內源性過氧化物酶的活性(Ⅰ型膠原標本組用1 %胰酶室溫消化45 min)。然后用10%山羊血清進行封閉，室溫下放置30 min，以封閉非特異性的結合位點。加入一抗兔抗鼠Ⅰ型膠原(稀釋度為1∶50)；兔抗鼠轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(稀釋度為1∶50)，4 ℃下孵育過夜。陰性對照組則使用PBS來代替一抗。加入生物素標記的羊抗兔二抗工作液。加入三抗用辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37 ℃下孵育30 min。以二氨基聯苯胺顯色5 min(顯微鏡下控制顯色的時間)后，終止顯色。使用蘇木精復染1 min，后用1%鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片。圖像分析及結果判定：用免疫組織化學染色的TGF-β1可見在細胞漿內表達。顯微鏡下可以觀察到棕黃色為陽性。用真彩色病理圖像分析系統來計算結果。

2結果

2.13組血清中TNF-α水平比較單純染毒組血清中各時點血清中TNF-α水平均高于空白對照組，且隨著時間的延長，單純染毒組TNF-α水平逐漸升高；丹紅治療組血清中各時點TNF-α水平均低于單純染毒組，且隨著時間的延長，丹紅治療組TNF-α水平逐漸降低，但仍高于空白對照組。3組在組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　3組血清中TNF-α水平比較

2.2肺組織形態學改變空白對照組肺泡結構比較清晰而且肺泡壁相對較完整，未出現明顯肺泡壁充血及增厚，肺泡腔內亦未見炎性細胞浸潤。單純染毒組1 d時出現明顯的急性肺泡炎癥，如形成部分透明膜、肺水腫、彌漫性肺出血以及炎性細胞的浸潤等;7 d 時仍主要為肺泡炎性改變; 14 、28 d 時出現不同程度的肺泡間質纖維性增厚、纖維組織增生，可見玻璃樣變。丹紅治療組也出現單純染毒組的表現，但程度較單純染毒組輕。

2.33組肺組織中TGF-β1水平比較單純染毒組血清中各時點肺組織中TGF-β1水平均高于空白對照組，且隨著時間的延長，單純染毒組TGF-β1水平逐漸升高；丹紅治療組肺組織中各時點TGF-β1水平均低于單純染毒組，且隨著時間的延長，丹紅治療組TGF-β1水平逐漸降低，但仍高于空白對照組。3組在組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　3組血清中TGF-β1水平比較

3討論

肺是百草枯中毒后損傷的主要靶器官,可引起不可逆的進行性肺纖維化，最終導致患者呼吸衰竭死亡。百草枯中毒所致的肺損傷表現為早期肺泡上皮細胞受損,肺泡內出血水腫,炎癥細胞浸潤,晚期可出現肺泡內和肺間質纖維化,這種表現被命名為 “百草枯肺”[1]。肺纖維化是百草枯中毒導致患者呼吸衰竭死亡的主要原因。百草枯中毒引起肺間質纖維化的形成機制極其復雜，其中TGF-β1是肺間質纖維化形成的關鍵因子[2]。研究發現丹紅注射液輔助治療百草枯中毒肺纖維化有較好的療效[3]。丹參的化學成分[4]為脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類,后者包括丹參素、原兒茶醛和丹參酸。紅花黃色素是從紅花中提取出的有效成分，具有使冠狀動脈擴張、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、降血脂以及耐缺氧等作用，從而被廣泛應用于心腦血管病的治療[5-8]。

百草枯灌胃染毒是誘導大鼠肺發生纖維化可靠方法之一，博萊霉素經氣管內注入法廣泛地用于制作大鼠實驗性肺纖維化模型[9]，研究發現，在給予百草枯灌胃后，大鼠出現張口呼吸、呼吸頻率加快、氣促、呼吸困難等改變，經肉眼觀察可發現肺臟的體積出現變化，顏色變得不均勻，先是輕度充血，后充血加重，充血減輕，繼而變得蒼白，開始出現瘀血，或者粉紅色相間等改變，最后出現纖維瘢痕灶，逐漸加重[10]。實驗表明，百草枯灌胃染毒是目前制造肺纖維化動物模型可靠的方法，而且灌胃染毒比腹腔內注射染毒能更好地模擬百草枯臨床中毒的特點[11-12]，值得在百草枯中毒相關研究中進行推廣。

TNF-α既是參與機體的免疫防護的重要介質，又可以參與機體的免疫病理損傷。正常水平的TNF-α可以調節免疫應答、抗感染、促進組織修復、引起腫瘤細胞凋亡等。研究[13]發現,在大鼠肺成纖維細胞中 TNF-α能使TGF-β1表達上調,主要是TNF-α可以活化細胞外信號調節激酶 ( extracellular signal-regulated kinase,ERK),而 ERK的抑制劑則可以抑制 TGF-β1mRNA和蛋白的產生。

百草枯中毒后，肺部癥狀主要表現為可誘導肺上皮HPAEpiC細胞發生上皮間質轉化，促進發生肺間質纖維化[14]。TGF-β1具有促進氣道平滑肌細胞增殖的作用，能夠促使成纖維細胞產生膠原和氨基多糖，誘導使成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，進而促使肺纖維化的形成。因此，在氣道結構的變化中，TGF-β1又是一種致纖維化因子，導致肺纖維化改變，加重肺功能的進行性損害。

本研究結果顯示，單純染毒組肺臟組織中TGF-β1表達逐漸增加，丹紅治療組TGF-β1蛋白的表達水平較單純染毒組明顯降低，證實丹紅注射液可以影響百草枯中毒大鼠肺組織中 TGF-β1的表達，使TGF-β1的表達減少。提示丹紅注射液具有抗纖維化作用，其抗肺纖維化作用可能與肺組織中TGF-β1表達有關。

綜上所述，丹紅注射液能通過抑制TGF-β1的合成、降低血清中TNF-α水平，減少細胞外基質異常積聚，對百草枯中毒大鼠肺臟具有保護作用。

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(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2014-11-26；[修回日期]2014-12-14

[作者簡介]韋紅梅(1978-)，女，河北定興人，河北省安國市醫院主治醫師，醫學學士，從事呼吸內科疾病診治研究。

[中圖分類號]R595.9

[文獻標志碼]B

[文章編號]1007-3205(2015)04-0441-04