匹伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注后氧化應激作用的影響

尤　楊，馮　倩，夏　岳*，戚國慶，張　燕，張慶文

(1.河北醫科大學第一醫院心內三科,河北 石家莊 050031;

2.河北省張家口市第一醫院心內三科,河北 張家口 075000)

·論著·

匹伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注后氧化應激作用的影響

尤楊1，馮倩2，夏岳1*，戚國慶1，張燕1，張慶文1

(1.河北醫科大學第一醫院心內三科,河北 石家莊 050031;

2.河北省張家口市第一醫院心內三科,河北 張家口 075000)

[關鍵詞]心肌再灌注損傷；匹伐他汀；氧化性應激

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.001

對于急性心肌梗死患者，盡早開通梗死動脈，迅速而持久地恢復梗死動脈的前向血流，對于挽救瀕臨死亡的心肌、防止擴大梗死面積、保護心肌的泵血功能、提高早期存活率和降低病死率有著極其重要的意義。而缺血心肌在一定時間內恢復血液再灌注后，原心功能不僅沒有恢復，反而出現了使功能代謝障礙及結構破壞進一步加重的現象，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。其機制尚未明確，目前已成為困擾臨床診療效果的重要問題以及研究熱點。他汀類藥物，即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A抑制劑，是目前臨床上應用最廣泛的調脂藥物，且在防治MIRI的研究中，其顯示出多種機制的心臟保護作用。本研究通過制作匹伐他汀預處理的大鼠心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)模型，觀察匹伐他汀預處理是否能減輕大鼠MIRI，縮小心肌梗死面積，并進一步探討其機制，旨在為他汀類藥物在干預缺血再灌注心肌的臨床應用上提供更多的理論依據。報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物成年雄性清潔級SD大鼠42只，體質量(250±20) g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號為醫動字第04037，動物等級為無特定病原體動物。將42只SD大鼠隨機分為3組各14只，術前3個組均于每日上午8:30~9:30，25 ℃室溫下以生理鹽水等量等溫灌胃，1次/d。假手術組(Sham組)生理鹽水2 mL/d灌胃4周，術中冠狀動脈的左前降支(left anterior descending，LAD)下只穿線，不結扎，也不再灌注。IR組生理鹽水2 mL/d灌胃4周，術中結扎LAD 30 min，再松解120 min，建立IR模型。匹伐他汀組(Statin組)術前匹伐他汀0.42 mg·kg-1·d-1用生理鹽水溶解成2 mL，1次/d，灌胃4周，建模過程同IR組。

1.2主要試劑超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)；BAC蛋白定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)檢測試劑(河北醫科大學第一醫院檢驗科提供)；伊文思藍(美國Sigma公司)；氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC，美國Sigma公司)；10%水合氯醛(河北醫科大學第一醫院中心實驗室)；10%福爾馬林溶液(河北醫科大學第一醫院中心實驗室)；總蛋白提取(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(河北醫科大學第一醫院中心實驗室自行配制)；抑肽酶(河北醫科大學第一醫院中心實驗室提供)；匹伐他汀片劑(2 mg/片，日本興和株式會社)。主要儀器：ECG-9620P三道自動分析心電圖機(上海光電醫用電子儀器有限公司)；HX-3實驗用人工呼吸機(正達實驗儀器開發公司)；手術器械、7/0Prolene線(河北醫科大學第一醫院手術室)；顆粒制冰機(青島阿伊斯曼公司)；電子天平(德國Sartorius AG公司)；SBHW-Ⅳ電熱恒溫水浴箱(北京市醫療設備廠)；LDZ5-2型低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠)；Centrifuge 5417R低溫離心機(德國制造)；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科器研究所)；-80 ℃冰箱(日本三洋公司)；-20 ℃冰箱(青島伊萊克斯有限公司)；UNICEL DXC800全自動生化分析儀(德國BECKMAN COULTER公司)；722型分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.3方法參照文獻[2-3]的方法制作模型。經10%水合氯醛以3 mL/kg腹腔注射麻醉，氣管插管，接人工呼吸機。以針式電極插入實驗大鼠四肢皮下，尾端連接于心電圖相應的肢體導聯線上，以Ⅱ導聯記錄，記錄正常心電圖(紙速100 mm/s,電壓20 mm/mV)作為對照。開胸，使左心耳與肺動脈圓錐之間的心大靜脈清晰可見，以此靜脈為標志，結扎LAD。先在結扎線下放1根1 mm的乳膠管，結扎過程中觀察心肌顏色變化，結扎LAD造成左心室前壁心肌缺血30 min，然后松線再灌注120 min。模型制作成功標準：以結扎LAD后左心室前壁局部心肌立刻由鮮紅變深、發紺，心電圖顯示ST段弓背向上抬高≥0.2 mV，T波電壓進行性增高，或QRS波幅升高及時限增寬作為結扎成功標準；松開結扎線恢復冠狀動脈血流，以缺血部位心肌顏色恢復，T波迅速回落、ST段驟降50%以上作為LAD成功再通標準。

1.4觀測指標①大鼠實驗前后心電圖變化；②各組隨機抽取7只大鼠用于心肌梗死面積的測定，于實驗結束時間點再次原位結扎LAD，左心室內注射5%伊文思藍溶液1 mL，確定缺血區(無藍色)和非缺血區(藍色)，待大鼠口唇藍紫后迅速取左心室，垂直心室長軸切除心尖端3 mm厚心肌，其余心肌組織置-20 ℃冰箱冷凍30 min，然后自心尖向心底部垂直心室長軸切成厚2 mm切片4~5片，置1% TTC溶液中，在37 ℃恒溫水浴箱中避光孵浴10~15 min以區分缺血區及梗死區，以10%福爾馬林溶液固定24 h以增強染色顏色對比。以朝向心尖部的切面作為面積分析切面，藍色為正常心肌，淺紅色為缺血心肌，灰白色為梗死心肌，通過計算機分析軟件測定梗死區面積(area of necrosis，AN)，以心臟總梗死區面積占總危險區面積(area at risk，AAR，即缺血區與梗死區面積之和)的百分比(AN/AAR)表示梗死面積，以危險區面積占左心室面積(left ventricle，LV)的百分比(AAR/LV)表示危險區面積。其余7只大鼠留取血液及心肌組織樣本：于實驗結束時間點迅速開腹，下腔靜脈取血2 mL加入促凝管,室溫靜置并離心后，吸取上層血清，-20 ℃冰箱中保存，采用UNICEL DXC800全自動生化分析儀測定CK-MB含量；取血成功后立即垂直心室長軸切取結扎線以下所有心肌組織，液氮速凍后稱質量，于-80 ℃冰箱中保存，以黃嘌呤氧化酶法測總超氧化物岐化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性。

2結果

2.1心電圖變化結扎LAD前大鼠Ⅱ導聯心電圖顯示心律規整，無ST-T、QRS波的改變；成功結扎大鼠LAD后，心電圖出現QRS波群增寬，ST段迅速弓背向上抬高≥0.2 mV或伴T波抬高，還可出現病理性Q波或原有q波加深；恢復灌流時出現T波快速回落、ST段下降50%以上，再灌注時期還有如房室傳導阻滯、室性心動過速、心室顫動等再灌注心律失常發生。

2.2T-SOD含量和血清CR-MB水平比較與Sham組相比，IR組、Statin組心肌T-SOD含量顯著下降(P<0.01)，Statin組T-SOD含量較IR組升高，但未到Sham組水平(P<0.01)；與Sham組比較，IR組、Statin組血清CK-MB水平顯著升高(P<0.01)，但Statin組血清CK-MB水平低于IR組(P<0.01)。見表1。

表1　3組T-SOD含量及CK-MB水平比較 Table 1　T-SOD,CK-MB comparison among three groups

*P<0.01與Sham組比較#P<0.01與IR組比較(q檢驗)

2.3心肌梗死面積比較IR組、Statin組AAR/LV 差異無統計學意義(P>0.05)，即各組心肌缺血危險程度相似，與IR組相比，Statin組AN/AAR明顯減少(P<0.01)。見表2。

表2　2組心肌梗死面積比較Table 2　Myocardial infarction area comparison between two groups

3討論

目前MIRI的機制尚未完全明確，主要觀點認為能量代謝障礙是其發生的基礎，在MIRI過程中自由基、鈣超載、細胞凋亡、能量代謝障礙、細胞因子、血管內皮細胞損傷及中性粒細胞浸潤等起重要作用。他汀類藥物除有效降低膽固醇外，還具有獨立于降脂作用以外其他有益的作用，具有多途徑心臟保護作用。他汀的非降脂作用包括改善血管內皮功能[4]、抗炎[5]、抗氧化應激[6]、抗血小板聚集和抑制血栓形成[7]、抑制心臟電生理重構、調節心臟自主神經功能[8]等。最近研究[9]還發現他汀類藥物能有效減輕MIRI。MIRI時氧自由基(oxygen free radical,OFR)的暴發是其重要的發病機制之一[10]。OFR是一類重要的細胞應激原，性質極不穩定，可造成生物膜結構破壞，細胞核分子變性等不良后果。正常情況下，體內過多的OFR可不斷被抗氧化系統及時消除，機體隨時處于氧化-抗氧化的平衡狀態中。當組織細胞發生缺血、缺氧時，OFR清除功能降低或喪失，生成系統活躍，一旦再次恢復組織血流和氧的供給時，OFR便瞬間大量產生，并在體內急劇堆積，此時機體就處于氧化應激狀態。OFR通過攻擊組織內皮細胞膜脂質中的不飽和脂肪酸，使膜的結構和功能改變，膜流動性降低，通透性增加等；還可使Ca2+通道通透性增加，導致細胞內Ca2+超載，介導炎性物質產生，造成整個細胞結構與功能的損傷。OFR增加還直接抑制一氧化氮生成，導致血管內皮損傷，觸發細胞凋亡[11]。

人體內存在完整的抗氧化系統來保持機體氧化-抗氧化平衡，其中SOD是最重要的抗氧化酶之一。SOD存在于細胞線粒體內，通過歧化作用使氧離子進一步轉化為水和氧氣，使機體維持正常生理功能，免受OFR損害。SOD 的活性可間接反映機體清除自由基和抗氧化損傷的能力[12]。SOD清除OFR的能力是有限的，如果過氧化物質產生過多，超過SOD的清除能力，就會使機體遭受OFR的氧化損傷[13]。本研究成功建立大鼠IR模型，定量檢測T-SOD含量，根據T-SOD可間接反映機體清除OFR的能力來評價匹伐他汀是否能使OFR清除增多，細胞受損程度減輕。

本研究結果顯示,Staitin組較IR組CK-MB水平顯著下降，心肌梗死面積減少，T-SOD下降程度減輕。說明Staitin組大鼠較單純IR組機體的抗氧化能力相對增強，可提高缺血再灌注后機體清除OFR的能力，保護心功能。表明匹伐他汀可明顯提高機體的抗氧化能力，且降低了心肌受損程度，提示其抗氧化應激作用是減輕MIRI機制之一。

[參考文獻]

[1]Schulze CJ，Wang W，Suarez-Pinzon WL，et al.Imbalance between tissue inhibitor of metalloproteinase-4 and matrix metalloproteinases during acute myocardial [correction of myoctardial] ischemia-reperfusion injury[J].Circulation，2003，107(19):2487-2492.

[2]Zhang LP,Yang CY,Wang YP，et al.Protective effect of polydatin against ischemia/reperfusion injury in rat heart [J].Sheng Li Xue Bao,2008,60(2):161-168.

[3]金英，關雷，王永安.心肌缺血再灌注損傷動物模型建立的主要影響因素[J].國際藥學研究雜志，2009，36(6):423-425，430.

[4]葉樹林，王曉蕾，陳利平.丹參多酚酸鹽對兔心肌再灌注損傷的保護作用[J].軍醫進修學院學報，2011，32(6):654-655，658.

[5]劉巧麗，張克成，王廣友，等.阿托伐他汀對大鼠急性心肌缺血再灌注無復流現象的影響及其機制[J].中國心血管雜志，2011,16(3):214-217.

[6]黃景文,楊澤福,羅韶金,等.他汀類藥物降低急性心肌梗死患者血漿內皮素及無復流現象[J].廣東醫學,2011,32(4):473-475.

[7]Liu H，Bai XB，Shi S，et al.Hydrogen sulfide protects from intestinal ischaemia-reperfusion injury in rats[J].J Pharm Pharmacol，2009，61(2):207-212.

[8]Reiter RJ,Tan DX,Qi W,et al.Pharmacology and physiology of melatonin in the recduction of oxidative stress in vivo[J].Biol Sigals Recept,2000,9(3/4):160-171.

[9]侯倩,崔煒.他汀類藥物對心肌再灌注后無復流現象作用機制的研究進展[J].中國心血管雜志,2013,18(5):391-394.

[10]Vasilieva E,Kasyanova O,Shpektor A.The antiplatelet effect of atorvastatin in patients with acute coronary syndrome depends on the hs-CRP level[J].Acute Card Care,2008,10(3):181-184.

[11]宋增新，李擁軍，張寧，等.阿托伐他汀對兔心肌缺血再灌注誘導細胞凋亡的影響[J].河北醫科大學學報，2008,29(4):501-503.

[12]劉榮華,李海濤.丹酚酸B對心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制研究概況[J].牡丹江醫學院學報,2007,28(1):58-60.

[13]宗春繞，周其華，李靖,等.大劑量阿托伐他汀序貫治療抑制急性心肌梗死溶栓后心肌損傷[J].臨床薈萃,2012,27(24):2177-2179. CJ，Wang W，Suarez-Pinzon WL，et al.Imbalance between tissue inhibitor of metalloproteinase-4 and matrix metalloproteinases during acute myocardial [correction of myoctardial] ischemia-reperfusion injury[J].Circulation，2003，107(19):2487-2492.

(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2014-05-26；[修回日期]2014-06-24

[基金項目]河北省科學技術研究與發展計劃項目(112761155)

[作者簡介]尤楊(1980-)，女，河北無極人，河北醫科大學第一醫院主治醫師，醫學碩士，從事心血管疾病診治研究。

*通訊作者

[中圖分類號]R542.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)04-0373-04

[摘要]目的探討匹伐他汀對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的保護作用，為他汀類藥物在缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)心肌的臨床應用提供理論依據。方法將成年雄性SD大鼠42只隨機分為假手術組(Sham組)、IR組及實驗組(Statin組)各14只。Sham組與IR組術前給予生理鹽水2 mL/d灌胃4周，Statin組給予匹伐他汀0.42 mg·kg-1·d-1，溶解成2 mL灌胃4周。制作大鼠心肌IR模型：Sham組冠狀動脈下只穿線，不結扎；IR組、Statin組結扎冠狀動脈左前降支30 min，再松解120 min。術后檢測血清中肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)水平，留取結扎線下部分心肌組織用黃嘌呤氧化酶法測心肌總超氧化物岐化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性，用氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)、伊文思藍雙染色法測定各實驗組心肌梗死面積及缺血區面積。結果與Sham組相比，IR組、Statin組的血清CK-MB升高，T-SOD含量下降(P<0.01)；Statin組CK-MB升高程度不及IR組(P<0.01)，T-SOD含量下降程度不及IR組(P<0.01)。IR組和Statin組危險區面積差異無統計學意義(P>0.05)；與IR組相比，Statin組梗死面積明顯減小(P<0.01)。結論匹伐他汀可以提高機體抗氧化能力，減輕再灌注后心肌壞死程度，減輕MIRI。

Effects of pitavastatin on role of oxidative stress in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion

YOU Yang1,FENG Qian2,XIA Yue1*,QI Guo-qing1,ZHANG Yan1，ZHANG Qing-wen1

(1.Department of Cardiovascular Medicine Ⅲ,the First Hospital of Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050031,China；2.Department of Cardiovascular Medicine Ⅲ, the First Hospital of

Zhangjiakou City,Hebei Province，Zhangjiakou 075000, China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of pitavastain on the role of oxidative stress in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion,which will provide a theoretical basis for pitavastain clinical application in myocardial ischemia-reperfusion.MethodsA total of 42 male SD rats were randomly assigned to three groups:Sham group, control group(IR group) and experimental group(Statin group).In Sham group and control group,2 mL saline was irrigated into stomach daily for four weeks, 0.42 mg/kg pitavastain dissolved in 2 mL saline was given in experimental group. In surgery, we wore line under the coronary artery without ligation in Sham group, and ligated the line for 30 minutes and then released it for 2 hours in IR group and Statin group.The levels of CK-MB were discerned after operation. Some myocardium tissue specimens under the line for ligation were used to detect the activity of total superoxide dismutase(T-SOD).The myocardial infarction size and risk area of each group were analyzed through comparing the differentiation of myocardium tissue stained by triphenyl tetrazolium chloride(TTC) and Evans blue by computer software system.ResultsThe levels of CK-MB elevated and T-SOD content decreased significantly in control group and experimental group as compared with Sham group(P<0.01).In IR group,the level of CK-MB was significantly higher than that of statin group,but lower when comes to T-SOD content(P<0.01).There were no statistical significance between statin group and IR group compared with area at risk(P>0.05). Statin group significantly reduced infarct size compared with IR group(P<0.01) .ConclusionPitavastatin could increase antioxidant capacity and it took a positive role in ischemia-reperfusion myocardial injury prevention.

[Key words]myocardial reperfusion injury；pitavastain；oxidative stress