兔椎間失穩后彈性內固定軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白變化的實驗研究

2015-12-28 01:27:57楊學軍宋雄英邢文華霍洪軍劉春楊

河北醫科大學學報 2015年7期

關鍵詞：內固定

張　昭，楊學軍，宋雄英，邢文華，霍洪軍，劉春楊

(1.北京市豐臺中西醫結合醫院骨傷科，北京 100072；2.內蒙古醫科大學第二附屬醫院胸腰脊柱外科，內蒙古呼和浩特 010030)

兔椎間失穩后彈性內固定軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白變化的實驗研究

張昭1，楊學軍2*，宋雄英1，邢文華2，霍洪軍2，劉春楊1

(1.北京市豐臺中西醫結合醫院骨傷科，北京 100072；2.內蒙古醫科大學第二附屬醫院胸腰脊柱外科，內蒙古呼和浩特 010030)

[摘要]目的觀察兔軟骨終板在椎間失穩環境下，經彈性內固定重建椎間穩定，軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的變化，為腰腿痛疾病的治療提供新的思路和方法。方法選取36只6個月齡日本大耳白兔,雄雌不限,體質量(2.5±0.15) kg，隨機分為對照組和實驗組各18只。先將實驗所用36只兔制作成L6/7椎間手術失穩模型；實驗組在手術失穩2個月后用椎弓根螺絲釘和張力鋼絲彈性內固定的方法進行L6/7的穩定性重建，術后2、4、6個月分別取2組兔椎間盤軟骨終板(每個時點6只)，用免疫組織化學的方法檢測Ⅱ型膠原蛋白,用JD801圖像分析系統進行圖像分析,綜合判斷軟骨終板的退行性變過程及機制。結果實驗組手術進行椎間失穩張力鋼絲彈性內固定穩定性重建后,2、4、6個月短期內椎間軟骨終板厚度較對照組明顯變厚，軟骨細胞顯著增加。實驗組Ⅱ型膠原蛋白灰度術后2～6個月逐漸下降，實驗組Ⅱ型膠原蛋白灰度術后2～6個月均低于對照組(P<0.01)；實驗組Ⅱ型膠原蛋白光密度術后2～6個月逐漸升高，實驗組Ⅱ型膠原蛋白光密度術后2～6個月均高于對照組(P<0.01)。結論彈性內固定能有效阻止軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的退行性變；而且有部分恢復的征象,為進一步進行其他治療創造了必要條件。

[關鍵詞]椎間盤退行性變；軟骨終板；膠原Ⅱ型；內固定

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.009

椎間盤軟骨終板的退行性變受生物體內部因素和其所處周圍外界因素影響，生物體在不同時間不同環境條件下，軟骨終板的退行性變是不同的,傳統的脊柱融合術一直是治療脊柱椎間盤退行性變疾病的“金標準”，堅強的后路內固定和椎間融合會影響脊柱的活動度,同時會導致固定節段相鄰椎間盤的退行性變加重，從而產生相應臨床癥狀，脊柱內固定術后存在潛在的并發癥[1]。關節失穩后的穩定性重建可阻止關節軟骨的退行性變，明顯緩解術后關節疼痛。椎間彈性內固定可有效治療由椎間失穩引起的腰腿痛，也可有效緩解鄰近節段椎間盤的退行性變[2]，并能適度保留椎體間的活動功能。為此，本實驗手術咬去兔L6椎體的兩側下關節突，改變腰椎內部結構造成椎間失穩,用張力鋼絲彈性內固定的方法重建椎間穩定性,觀察椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的變化過程[3],現報告如下。

1材料與方法

1.1實驗設計取36只6個月齡日本大耳白兔(由內蒙古農業大學動物中心提供),雄雌不限,平均體質量(2.50±0.15) kg，均在同樣環境條件下喂養，隨機分為實驗組和對照組各18只。先將實驗所用36只兔制備L6/7椎間手術失穩模型：刮除兔腰背部皮毛,用安定注射液1.25 mg/kg、氯胺酮0.02 g/kg、阿托品0.125 mg/kg依次一側耳緣靜脈注射麻醉后,俯臥固定于手術臺上,消毒后鋪無菌手術巾，取雙側平對髂嵴椎間隙(即L6/7)為中心,從正中切一長約4.5 cm縱行切口,切開皮膚及皮下組織,分離暴露棘突、雙側椎板及上下關節突，分離附著于棘突、椎板及小關節的肌肉等軟組織,然后咬除L6/7棘上及棘間韌帶,咬除L6椎體下位全部小關節突，造成兔椎間盤椎間失穩，用無菌生理鹽水充分沖洗切口3次,依次縫合各層組織；碘伏消毒手術切口，術后各兔在自己單籠中自由活動。實驗組18只兔在手術失穩2個月后用椎弓根螺絲釘和張力鋼絲彈性內固定的方法進行L6/7的穩定性重建(圖1，2)。將實驗組和對照組動物在術后2、4、6個月分別取材，采用免疫組織化學的方法對所取椎間盤軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白進行制片檢測,然后用JD801圖像分析系統進行Ⅱ型膠原蛋白圖像分析。

1.2試劑和設備APES防脫片劑(編號GLU-0048)、DAB顯色試劑盒(編號DAB-0031/1031)、SP超敏試劑盒(編號Kit-9710/9720/9730)、抗人的膠原蛋白Ⅱ單克隆抗體(編號MAB-0222)由福州邁新生物技術開發有限公司生產；分析純乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)由江蘇捷達科技有限公司生產。JD801圖像分析系統由江蘇捷達科技有限公司生產；手提便攜式X射線透視儀(BJI-1X型)/ BG-9000 C形臂X線機由德國產；HR-7751-M型微波爐由山東青島海爾公司生產；醫用手術器械一套;一次性無菌手術衣、無菌手術單及無菌手套；直徑2 mm 長10 mm指骨用螺釘30×4個,直徑0.9 mm醫用鋼絲3 m。

1.3操作方法

1.3.1取材用無菌注射器將25 mL空氣沿實驗兔耳緣靜脈注射栓塞將其處死,用快骨刀快速切取完整L6/7椎間盤(保留部分軟骨終板下松質骨)，放入中性甲醛溶液中固定,24 h后用15%EDTA溶液脫鈣。

1.3.2脫鈣將所取得的兔椎間盤軟骨終板組織放入裝有15% EDTA溶液的干凈安瓿中,安瓿用用硫酸紙標記所放標本性質,安瓿用瓶蓋封閉放入盛1 200 mL18 ℃左右自來水的塑料盆中,在微波爐中用中低兩檔加熱10 min,然后換1 200 mL18 ℃左右自來水繼續在微波爐中用中低兩檔加熱10 min,自來水用來控制軟骨終板組織脫鈣時的溫度始終控制在50℃以下,如此反復脫鈣每日2 h后換15% EDTA溶液,置入37 ℃溫箱中過夜,第2天再更換1次15% EDTA溶液，再按前一天方法進行微波脫鈣,如此反復15 d左右，完整椎間盤可完成脫鈣。

1.3.3制片載玻片清潔后用APES防脫片劑用丙酮50倍稀釋后常規處理,蓋玻片常規清潔處理。脫鈣后將組織用自來水沖洗2次，其間5%無水硫酸鈉飽和溶液浸泡，依次50%、70%、80%、95%(Ⅰ、Ⅱ)、100%(Ⅰ、Ⅱ)乙醇脫水，二甲苯透明，依次48～50 ℃、54～56 ℃、56～58 ℃軟蠟滲蠟，石蠟包埋、修塊、切片。

1.4Ⅱ型膠原蛋白的檢測用UltrasensitiveTMSP超敏試劑盒檢測按其說明書操作制片；JD801圖像分析系統檢測Ⅱ型膠原蛋白。

2結果

2.1軟骨終板的變化椎間失穩(對照組)可導致椎間軟骨終板在2～6個月短期內厚度明顯變薄，軟骨細胞顯著減少(圖3～5)；實驗組手術進行椎間失穩張力鋼絲彈性內固定穩定性重建后,在2～6個月短期內椎間軟骨終板厚度較對照組明顯變厚，軟骨細胞顯著增加(圖6～8)。

2.2Ⅱ型膠原蛋白的變化對照組Ⅱ型膠原蛋白灰度術后2～6個月逐漸升高(P<0.01)，而實驗組則逐漸下降(P<0.01)；實驗組Ⅱ型膠原蛋白灰度術后2、4、6個月均低于對照組(P<0.01)。對照組Ⅱ型膠原蛋白光密度術后2～6個月緩慢降低(P<0.01)，而實驗組Ⅱ型膠原蛋白光密度逐漸升高(P<0.01)；實驗組Ⅱ型膠原蛋白光密度在術后2～6個月均高于對照組(P<0.01)。見表1。

表12組術后Ⅱ型膠原蛋白灰度和光密度比較

Table 1Comparison in gray scale and optical density of collagen typeⅡbetween two groups

組別Ⅱ型膠原蛋白灰度2個月4個月6個月FP對照組310.28±0.91313.21±1.30*315.68±0.77*#42.2810.000實驗組290.28±0.87287.36±0.94*284.47±0.01*#40.2700.000t38.91339.47062.915P0.0000.0000.000組別Ⅱ型膠原蛋白光密度2個月4個月6個月FP對照組0.52±0.010.51±0.010.49±0.01*#14.0000.000實驗組0.56±0.010.61±0.010.64±0.01*#98.0000.000t6.92817.32125.981P0.0000.0000.000

*P<0.01與2個月比較#P<0.01與4個月比較(q檢驗)

3討論

頸肩痛、腰腿痛嚴重影響著人類的身體健康，而椎間盤的退行性變是導致頸肩痛、腰腿痛的主要原因。日前對椎間盤的退行性變過程及機制的認識有限,對構成椎間盤軟骨終板的退行性變的認識更少,傳統頸肩痛、腰腿痛均采用神經減壓椎間盤摘除椎間融合術，給患者帶來的負面影響是脊柱活動受限和鄰近節段椎間盤退行性變加重。近年來隨著分子生物學和基因技術等的臨床應用，激發人類不斷尋求干預椎間盤退行性變的新方法[4-8]。近期使用的脊柱彈性內固定系統(Bioflex、K-ROD、Dynesis、Coflex、人工椎間盤等)已取得了一定的臨床療效，但也存在一些不足；當前已有研究使用轉基因及組織工程技術重建或修復椎間盤，利用重組DNA技術和基因克隆技術人工獲得基因物質如骨形態蛋白、轉化生長因子、血小板衍生生長因子等[9-10]，這些治療因子僅在極短的一段時間內或只在某些特定環境條件下有效,始終不能達到預期效果[11-18]。為此，本研究應用張力鋼絲彈性內固定重建椎間穩定的方法來觀察椎間失穩后軟骨終板退行性變的過程，國內亦曾有過相關報道[19-20]。

本研究結果顯示：①正常結構的椎間盤及其周圍組織是椎間盤正常代謝功能的基礎，失穩狀態的椎間盤各種代謝均處于失代償狀態。②椎間失穩(對照組)可導致椎間軟骨終板在各實驗時間點厚度明顯變薄，軟骨細胞顯著減少，Ⅱ型膠原蛋白灰度術后2～6個月逐漸升高(P<0.01)，由于灰度值與陽性物質含量成反比，證明椎間失穩可導致椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的含量是逐漸減少的；同樣對照組Ⅱ型膠原蛋白光密度術后2～6個月緩慢降低(P<0.01)，光密度與陽性物質的含量成正比，再次證明對照組可導致椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的含量是逐漸減少的[21]。由此可推測椎間盤在失穩狀態下可直接影響軟骨細胞的活性和數量，從而影響Ⅱ型膠原蛋白的含量，進而直接影響到椎間盤的新陳代謝、結構和功能。③手術進行椎間失穩張力鋼絲彈性內固定穩定性重建后,在各實驗時間點椎間軟骨終板的厚度較對照組明顯變厚，軟骨細胞顯著增加,而實驗組Ⅱ型膠原蛋白灰度在2、4、6個月則是逐漸下降的(P<0.01)，Ⅱ型膠原蛋白光密度在2、4、6個月是逐漸升高的，不同時點間比較差異有統計學意義(P<0.01),證明實驗組可導致椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的含量增加；實驗組椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白灰度在2、4、6個月均低于對照組，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)，同樣也證明彈性內固定能有效阻止椎間軟骨終板的退行性變，可部分恢復退行性變的軟骨終板結構。椎間失穩在短期內可能由于局部力學結構的改變導致椎間盤軟骨終板機構和功能的改變，從而導致軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白明顯減少。臨床工作中積極預防椎體間失穩的出現可有效預防腰腿痛和頸肩痛的發生，椎間失穩后的椎間穩定性重建是有效的治療方法，同時也是進行其他有效治療的基礎。

綜上所述，椎間失穩是導致椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白在短期內退行性變的主要原因；用張力鋼絲彈性內固定的方法行椎間失穩后的穩定性重建，能有效阻止椎間軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的退行性變,并能使退行性變的軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白得到部分恢復。(本文圖見封二)

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