多重熒光PCR應用于下呼吸道感染病原菌檢測的研究

多重熒光PCR應用于下呼吸道感染病原菌檢測的研究

黃松潔 姚藝輝 晁鵬麗

目的應用多重熒光PCR技術檢測下呼吸道感染常見病原菌，為下呼吸道感染提供一種高效的診斷工具。方法建立多重熒光PCR法檢測下呼吸道感染常見細菌中的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌，應用該法檢測了112例臨床痰標本，并與細菌培養結果進行比對。結果在多重PCR反應體系中，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌的靈敏度為5×102copies/ml，肺炎鏈球菌的靈敏度為2．5×102copies /ml；多重熒光PCR檢測112例臨床痰標本，大腸埃希菌陽性率為9．8%，肺炎克雷伯菌陽性率為12．5%，銅綠假單胞菌陽性率為17．0%，肺炎鏈球菌陽性率為0．9%。結論多重熒光PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、通量高和速度快等優點，為下呼吸道感染診斷提供了新的檢測手段。

多重PCR；下呼吸道感染；檢測

下呼吸道感染是嚴重威脅人類健康的主要疾病之一，其死亡率居高不下的主要原因是沒有獲得及時、正確的診斷和治療。明確下呼吸道感染的病原體對于確立診斷和治療方案、指導抗生素使用、減少藥物副作用、減少病原體耐藥、縮短病程以及降低費用等具有重要意義。臨床上傳統的檢測方法，如組織形態學、免疫學和微生物培養鑒定等，存在著實驗周期長、靈敏度及特異性較差等缺點。本研究采用采用多重熒光PCR技術檢測下呼吸道感染常見細菌中的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌。多重PCR（multiplexPCR）［1］具有同時擴增多個目的基因、節省標本、節省時間、降低成本、提高效率的優點得到迅速發展，逐漸在生命科學的各個領域成為一項成熟而重要的研究手段［2］，對于傳染病的檢測與預防，具有不可替代的作用。

1 資料和方法

1.1 標本來源

痰標本112例，收集自2014年4月~ 2014年10月初診的社區獲得性肺炎患者；標準菌株來源：大腸埃希菌為ATCC25922，肺炎克雷伯菌為ATCC700603，銅綠假單胞菌為ATCC27853，肺炎鏈球菌為ATCC49619。

1.2 試劑與儀器

DEPC水、DNA提取用細胞裂解液購自凱杰（QIAGEN）生物工程（深圳）有限公司，PCR反應液（master mix）購自fermentas公司，引物及探針由invitrogen公司合成，PCR儀為美國ABI 7500。

1.3 標本處理

痰標本加入1～2倍體積的無菌生理鹽水，室溫放置約0.5 h至完全液化后進行核酸提取。標準菌株先進行細菌培養，用接種環挑取單個菌落上的少量細菌，加入裝有500 μl無菌生理鹽水的離心管中，充分混勻。

1.4 核酸提取

采用加熱煮沸裂解法：吸取200 μl液化痰標本或標準菌株懸液加入離心管中，13 000 rpm/min離心5 min，吸棄上清，加入200 μl無菌生理鹽水，充分震蕩后13 000 rpm/min離心5 min，吸棄上清，再加入50 μl裂解液，在恒溫加熱儀上100℃加熱10 min，然后13 000 rpm/min離心5 min，吸取上清并于－20℃保存備用。

1.5 引物、探針設計

采用primer premier 5.0軟件設計，然后通過BLAST進行同源性比對以保證其特異性。具體引物、探針設計見表1。

1.6 基因擴增

PCR反應體系：PCR反應總體積為50 μl，其中上述提取的DNA模板2 μl，多重PCR反應液（master mix）25 μl，引物濃度分別為大腸埃希菌引物對0.156 μmol/L，肺炎克雷伯菌引物對0.625 μmol/L，銅綠假單胞菌引物對0.08 μmol/L，肺炎鏈球菌引物對1.25 μmol/L，各探針濃度均為0.1 μmol/L，以無菌超純水補足50 μl體系。PCR反應條件：95℃ 10 min，1個循環；95℃15 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，40個循環。

表1 各菌株引物、探針設計表

1.7 實驗靈敏度驗證

應用細胞計數板計數將各標準菌液調配出1×104/ml、1×103/ ml、5×102/ml、2.5×102/ml、1.25×102/ml菌液，將各菌液提取DNA后進行PCR擴增，分批至少重復20次檢測，至少連續做三次，檢出率大于95%的最低濃度值為分析靈敏度。

2 結果

不論是單DNA模板檢測還是多DNA模板檢測，均得到有效擴增，反應曲線如圖1。

在多重PCR反應體系中，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌的靈敏度為5×102copies/ml，肺炎鏈球菌的靈敏度為2.5×102copies /ml，實驗反應曲線如圖2。

對112例臨床痰標本分別進行細菌培養和多重熒光PCR檢測，實驗結果多重PCR陽性率稍大于細菌培養陽性率。詳見表2。

3 討論

3.1 檢測方法

表2 112例痰標本陽性例數和百分比

目前臨床常用的下呼吸道病原菌檢測方法有痰涂片革蘭氏染色鏡檢、痰培養、血培養、PCR法等。革蘭氏染色鏡檢方法簡單，但難以發現輕中度社區獲得性肺炎的病原體且陽性結果的判定缺乏標準［3］。痰培養是目前最常用的診斷方法，但由于人體口咽部存在正常菌群，痰培養得到的細菌不一定是致病菌。定量培養法、半定量培養法能鑒別污染菌和致病菌。一般定量培養細菌數≥104CFU/ml（集落生成單位/ml）有臨床意義［4］，另外，連續2次以上分離到同一細菌也可認為是致病菌。血培養的作用目前有一定爭議，血培養若檢出病原菌，其特異性較高，但敏感性僅為20%［5］。應用PCR技術檢測痰標本的病原菌，具有速度快、敏感度較高、特異性好的優點，但痰標本存在PCR反應抑制物，在DNA提取過程中若不能有效去除抑制物，將影響PCR的靈敏度。

3.2 實驗分析

本實驗采用多重PCR方法，其基本原理與常規PCR相同，但實際反應遠比常規PCR復雜。首先，多重PCR 反應體系中同時存在幾對引物， 容易形成引物二聚體。另外，對某個靶序列的優先擴增（preferential amplification）是多重PCR中普遍存在的問題，目前的觀點認為這主要是由于PCR 漂移（PCR drift）和PCR 選擇（PCR selection）造成的［6］。在實驗中，從引物及探針設計、各引物濃度、退火及延伸的溫度和時間、擴增循環次數等方面對實驗進行優化，以保證多重PCR的靈敏度和特異性，并盡量使多重擴增的效率趨于一致。本實驗靈敏度符合臨床要求，多重PCR陽性率稍大于細菌培養陽性率，考慮為培養法靈敏度低于PCR法，亦不排除患者在初診前自行服用抗生素，抑制了細菌的生長。

圖1 各病原菌熒光PCR擴增曲線圖

圖2 各病原菌靈敏度實驗的熒光PCR擴增曲線圖

3.3 結論和展望

本實驗建立的多重熒光PCR檢測方法具有多通量、靈敏度高、特異性強、檢測不受抗生素影響等優點，為下呼吸道感染診斷提供了新的檢測手段，并為其臨床應用提供了良好的實驗基礎。本實驗亦具有局限性，首先，PCR法不能區分是活動性感染還是潛伏性感染；另外，目前熒光PCR儀最多只有5個檢測通道，限制了本實驗的檢測通量，如在擴增時分管檢測，則可以進一步提高實驗的檢測通量。

［1］Chambercian J S，Gibbs R A，Ranier J E，et al．Detection screening of the duchenne muscular dystrophy locus via mutiplex DNA amplification［J］． Nucl Acids Res，1988，16（16）：1141-1156．

［2］Ponce M R，Robles P，Micol J L．High-throughput genetic mapping in Arabidopsos thaliana［J］．Mol Gen Genet，1999，261（2）：408-415．

［3］Theerthakarai R， Halees W， Solis R A， et al． Nonvalue of the initial microbiological studies in the management of nonsevere community- acquired pneumonia［J］．Chest，2001，119（1）：181-184．

［4］葉應嫵，王毓三，申子瑜． 全國臨床檢驗操作規程［M］．3 版．南京：東南大學出版社，2006，10：745．

［5］Luna C M， Videla A， Mattera J， et al． Blood cultures have limited value in predicting severity of illness and as a diagnostic tool in ventilator-associated pneumonia［J］． Chest，1999，116（4）：1075-1084．

［6］Elnifor E M，Ashshi A M，Cooper R J， et al．Multiplex PCR：Optimization and Application in Diagnostic Virology［J］．Clin Microbiol Rev，2000，13（4）：559-570．

Detection of Pathogenic Bacteria in Lower Respiratory Tract Infection by Multiplex Fluorescent PCR

HUANG Songjie YAO Yihui CHAO Pengli Clinical laboratory，Zhongshan Hospital affiliated with Xiamen University，Zhongshan 361004，China

ObjectiveTo establish a highly efficient technique of diagnosis to detect common Pathogenic bacteria leading to lower respiratory tract infections using multiple fluorescence PCR technique．MethodsUsing multiple fluorescent PCR to detect common bacteria leading to the lower respiratory tract infection such as e． coli， klebsiella pneumoniae， pseudomonas aeruginosa and s． pneumonia in the 112 samples of clinical sputum specimens， and compare with the results of bacterial culture．ResultsThe sensitivity of the test by multiple PCR method for e． coli，klebsiella pneumonia and pseudomonas aeruginosa was 5 × 102copies/ml， and for streptococcus pneumonia was 2．5 × 102copies/ml． In 112 sputum specimens collected from clinical respiratory tract infection， the positive rate of e． coli klebsiella pneumonia， pseudomonas aeruginosa and streptococcus pneumonia were 9．8%， 12．5%， 17．0% and 0．9% respectively．ConclusionMultiplex fluorescent PCR detection method has the advantages of high sensitivity， high specificity， high throughput and high speed． It provides a new detection method for the diagnosis of lower respiratory tract infections．

Multiplex PCR，Lower respiratory tract infection，Detection

R56

A

1674-9316（2015）29-0155-04

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．29．115

361004廈門大學附屬中山醫院檢驗科 基金項目：福建省衛生廳青年基金（2010-2-95）