先天梅毒實驗室診斷方法學研究

先天梅毒實驗室診斷方法學研究

苗 巖 歐春怡 王 偉 李 卓 王學斌 齊紹偉

目的研究先天梅毒實驗室檢測實用性、特異性的方法，應用于新生兒梅毒的早期診斷。方法應用國內外最新的梅毒檢測技術，以梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）與甲苯胺紅不加熱血清試驗 （TRUST）作為基礎實驗，輔以其它特異性診斷實驗，達到快速、準確、特異的診斷目的。結果2010～2014年全院共檢測門診及住院患者66 338例，其中，產科住院孕產婦30 225例，產科門診孕產婦10 250例，針對性檢測臨床疑似新生兒梅毒感染患兒189例，其中住院孕產婦雙陽性率（TPPA、TRUST均陽性）0．36%，產科門診孕產婦雙陽性率0．63%，疑似新生兒梅毒感染患兒陽性率19．58%。檢出新生兒梅毒患兒11例，約占住院孕產婦0．36‰。結論使用逆向操作法應用于常規梅毒組合檢測，采用蛋白印跡技術針對性檢測，提高了孕產婦及新生兒梅毒檢測的特異性，應用于新生兒胎傳梅毒的早期診斷可為臨床診斷先天梅毒提供依據。

蒼白密螺旋體；先天性梅毒；蛋白印跡技術；實時熒光定量PCR

1 材料與方法

1.1 標本來源

2010年1月～2014年12月本院所有門診及住院患者66 338例。所有陽性血清標本均冰凍保存2年以上，以備復檢。

1.2 試劑

TPPA試劑由日本富士瑞必歐株式會社提供，TRUST試劑由上海榮盛生物技術有限公司提供，免疫印記法（WB）所使用的抗梅毒螺旋體（IgM）檢測試劑盒由德國歐蒙醫學實驗診斷股份公司提供。ELISA檢測試劑盒由北京萬泰生物科技有限責任公司提供。實時熒光定量PCR（FQ-PCR）方法試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供。

1.3 診斷方法

依據衛生部2007年頒布的中華人民共和國衛生行業標準WS273-2007《梅毒診斷標準 》。

1.4 檢測程序

住院孕產婦患者首先采用TPPA方法進行檢測，陽性患者做TRUST 1：2 ～ 1：128倍血清稀釋，其滴度可作為療效觀察的判斷指標。采用這種逆向操作的方法，即保證了試驗方法的準確性和特異性，又提高了檢驗速度。對于孕產婦雙陽的患者，加做WB檢測，出生患兒也采用蛋白印跡進行檢測，同時輔以FQ-PCR進行檢測，加作ELISI方法進行比對試驗，對于無臨床體征及癥狀的出生后患兒進行跟蹤隨訪1年以上，用以排除胎傳梅毒。所有實驗步驟及結果判讀均嚴格按照試劑盒使用說明書進行操作，且由2人分別判讀。

2 結果

2.1 梅毒血清學檢測結果及方法學比較

梅毒血清學檢測結果及方法學比較詳見表1，表2。

2.2 陽性檢出率及構成比

自2010年1月～2014年12月全院門診及住院患者梅毒檢測標本共計66 338例。其中產科門診檢測10 250例，單陽（僅TPPA陽性）181例，陽性率1.77%，構成比16.41%；雙陽（TPPA、TRUST均陽性）68例，陽性率0.66%，構成比9.3%。產科住院檢測30 225例，單陽127例，陽性率0.42%，構成比11.51%；雙陽110例，陽性率0.37%，構成比15.06%。疑似新生兒梅毒感染患兒檢測189例，單陽129例，陽性率68.25%，構成比11.7%；雙陽37例，陽性率19.58%，構成比5.06%。確診新生兒梅毒11例，約占住院孕產婦0.36‰。

2.3 TRUST滴度

采用5種方法，配對檢測166例產科住院分娩的母嬰標本，其中母親雙陽110例，單陽56例。檢測出嬰兒單陽129例，雙陽37例。確診新生兒梅毒11例，其TRUST滴度均≥母體血清滴度。

3 討論

當人類感染蒼白密螺旋體后，最先刺激機體產生IgM抗體，患者一般感染2周后即可檢出，而IgG則在感染4周后方可測出，感染時間少于3周，血清學檢測可能出現陰性即所謂的窗口期，妊娠梅毒的篩查工作應每月進行1次，蒼白密螺旋體IgG分子量較小，能夠穿透胎盤屏障，所以母親TPPA檢測單陽或雙陽，一般新生兒出生后抗體（IgG）檢測均為陽性，6個月～1年后可自然消失。因此，選擇WB或FQ-PCR的方法檢測人體內IgM抗體，用于蒼白密螺旋體感染的早期診斷是目前診斷先天梅毒最好的實驗診斷方法。特別是對于無臨床癥狀的新生兒，亦不能排除胎傳梅毒的可能性，應用兩種方法聯合檢測更為有效。

表1 166例新生兒母子（女）梅毒血清學檢測結果

表2 5項檢測方法敏感度、特異度（%）

ELISA方法檢測的是IgG和IgM的混合抗體，用于自動化檢測系統大批量篩查，對于孕產婦及新生兒檢測，敏感度和特異度相對較差，無法滿足臨床特殊需求。TRUST方法檢測的是非特異抗體，僅適合用于療效觀察，通常認為新生兒TRUST滴度高于母親4倍，高度懷疑先天性梅毒［1］。本研究結果提示，只要新生兒TRUST滴度＞1：16，或子（女）TRUST滴度高于母親滴度，均應高度懷疑先天梅毒，應用WB（IgM）方法進行最后確認。TPPA檢測的是IgG抗體，特異性高，假陽性少，可作為梅毒的確證實驗，但只要感染蒼白密螺旋體，此抗體一般會終生攜帶，針對梅毒早期診斷缺陷明顯［2］。FQ-PCR應用于先天梅毒檢測具有特異度、敏感度高、定量準確的特點，特別是PCR技術能夠檢出臨床標本TP-DNA，提示低載量感染，如果患者同時存在HIV感染時，會出現假陰性，此方法檢測腦脊液是證實感染的唯一方法［3-4］，但是應用此項技術，需建立高質量的PCR實驗室及配套實驗設備，只適合于較大的三甲級醫院開展，普通基層醫院難以普及。采用WB方法檢測IgM抗體，具有操作簡便、快速準確的特點，且無抗體交叉反應的干擾，溶血、脂血、黃疸對檢測結果均無影響。本研究結果顯示應用蛋白印記檢測技術檢測IgG和IgM敏感度和特異性均為100%。歐蒙試劑廠家給出的WB（IgM）檢測試劑盒特異性為98%，敏感度為100%，有可能與我們檢測的樣本量較小有關，有待于增大樣本量，做進一步的觀察和研究。陽性預測值為94%，所以在診斷新近感染時，IgM陽性標本，最好在3～6周后重新檢測患者血液樣本WB（IgG）是否為陽性。

從優生學角度考慮，一旦母親發生梅毒螺旋體感染，TRUST滴度＞1：16，胎兒IgM檢測陽性，發生宮內感染機會較大，一般妊娠預后較差，采取引產方式終止妊娠為宜。近十年來，我們采用入院孕產婦患者首先檢測TPPA，陽性標本做TRUST滴度，無論單陽或雙陽母嬰均做WB（IgM）檢測，提高了先天梅毒檢測的靈敏度、準確度及檢出效率，及時為臨床選擇治療時機及終止妊娠提供參考，減少院內感染率的發生，同時為流行病學調查提供參考依據。

［1］苗巖，歐春怡，任惠斌，等． 41482株蒼白密螺旋體血清學檢測結果分析［J］． 中華醫院感染學雜志，2011，21（4）：829-830．

［2］苗巖，歐春怡，王學斌，等． 先天性梅毒實驗室檢測方法學評價［J］． 中華全科醫學雜志，2012， 10（7）：1137-1138．

［3］歐春怡，苗巖，祖虹． 新生兒先天性梅毒的實驗室診斷與臨床應用［J］． 中華兒科雜志，2011，49（11）：869-871．

［4］Gayet-Ageron A，Ninet B，Toutous-Trellu L，et al． Assessment of a real-time PCR test to diagnose syphilis from diverse biological samples［J］． Sex Transm Infect，2009，85（4）：264-269．

Laboratory Diagnosis and Methodology Research on Congenital Syphilis

MIAO Yan OU Chunyi WANG Wei LI Zhuo WANG Xuebin QI Shaowei Clinical Laboratory of Red Cross Central Hospital，Harbin 150076，China

ObjectivePractical and specificity of laboratory testing on congenial syphilis are to be researched in order to apply it to diagnose early-stage congenial syphilis in new-born babies．MethodsApplication of abroad latest laboratory testing technique based on TPPA and TRUST， and supplemented other specific laboratory tests in order to make the rapid，accurate and specified diagnosis．ResultsThere are totally 66 338 patients treated clinically and hospitalized from 2010 to 2014，including 30 223 cases of hospitalized pregnant patients，10 250 cases of clinically treated pregnant patients and 189 cases of clinically suspected congenial syphilis new-born babies． TPPA and TRUST of hospitalized pregnant patients were up to 0．36%，while，TPPA and TRUST of clinically treated pregnant patients were up to 0．63%． And the positive rate of suspected newborn babies infected with congenital syphilis was 19．58%，there are 11 newborn babies diagnosed as congenital syphilis，accounting for 0．36‰ of pregnant patients in total．ConclusionApplication of reverse operation to test routine syphilis and application of western blotting to test specific syphilis are conducive to increasing specificity of syphilis test for pregnant women as well as newborn babies，and what’s more，the early-stage diagnosis of newborn babies could provide basis for clinical diagnosis of congenital syphilis．

Treponema pallidum，Congenital syphilis，Protein imprinting technology，Real-time fluorescent quantitative PCR

R759．152

B

1674-9316（2015）27-0139-02

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．27．102

150076 哈爾濱市紅十字中心醫院檢驗科

苗巖，E-mail：miaoyan6565@163．com

黑龍江省衛生廳科研課題項目（項目編號：2012-069）哈爾濱市科技創新人才研究專項資金項目（項目編號：2012RFQYS055）