CGRP通過抑制p38MAPK/ NOX4通路保護氧化應激誘導的血管內皮細胞損傷

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(1.南華大學附屬第二醫院心血管內科 湖南 衡陽 421001;2.廣東省第二人民醫院藥物臨床試驗基地;3.南華大學 湖南省分子靶標新藥研究協同創新中心)

·基礎醫學·

CGRP通過抑制p38MAPK/ NOX4通路保護氧化應激誘導的血管內皮細胞損傷

歐奇林1，曾泗宇2，駱競妃3，彭虹艷3，洪陳亮3，曾高峰1，秦旭平3*

(1.南華大學附屬第二醫院心血管內科 湖南 衡陽 421001;2.廣東省第二人民醫院藥物臨床試驗基地;3.南華大學 湖南省分子靶標新藥研究協同創新中心)

目的觀察降鈣素基因相關肽(CGRP)對氧化應激損傷血管內皮細胞的保護作用及其對p38 MAPK/NOX4信號通路的抑制作用。方法體外培養人臍靜脈內皮細胞株(HUVECs)，外源性給予過氧化氫(H2O2)或血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)作為氧化刺激因素，CGRP作為保護劑處理細胞。噻唑藍比色法(MTT)觀察HUVECs活力；流式細胞儀(FCM)觀察分析HUVECs增殖指數的改變； Western Blot和Real-time PCR分別檢測p38 MAPK、NADPH氧化酶4 (NOX4)蛋白和mRNA的表達。結果500 μmol/L H2O2或100 nmol/L AngⅡ能濃度依賴性地降低HUVECs活力和增殖指數(PI)；CGRP可以顯著增加HUVECs活力和及其PI。同時，H2O2、AngⅡ均能誘導p38 MAPK磷酸化，并能上調NOX4蛋白和mRNA表達，p38 MAPK阻斷劑能部分增強CGRP抑制AngⅡ或H2O2誘導的NOX4的表達。結論CGRP對內外源性的氧化應激損傷HUVECs的保護機制可能與抑制p38 MAPK/NOX4信號通路有關。

降鈣素基因相關肽； 氧化應激； 內皮細胞； NADPH氧化酶4

血管內皮損傷及其功能紊亂是引起心血管疾病發生發展的起始事件[1]。探討內皮損傷的病理過程對治療各種心血管疾病具有重要意義。活性氧(ROS)主要包括羥基自由基(-OH)、過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(-O2-)、單線態氧(1O2)等。近年研究表明ROS在內皮損傷中的作用不容忽視。多種細胞生長因子，如血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)[2]，血小板源性生長因子(PDGF)[3]能通過激發內源性的ROS損傷血管內皮細胞。研究明確煙酞胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶，簡稱NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)是血管內生成ROS的主要酶體[4]。有證據證明，NOX4在內皮細胞中的表達顯著高于其它Nox成員，研究數據證實NOX4對內皮氧化還原反應發揮關鍵作用，并對內皮細胞生理有重要的功能性調節作用[5]。降鈣素基因相關肽(CGRP)是目前已知的最強舒張血管的神經多肽，其舒張血管作用與保護內皮細胞功能相關[6]。本研究擬證明，CGRP通過對抗內外源性氧化應激保護內皮細胞功能的機制，為闡明CGRP的生理功能提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑人臍靜脈內皮細胞株 (HUVECs)(Catalog Number:C-003-5C) 購自上海拜力生物技術公司。CGRP、AngⅡ(Sigma公司)、β-actin多克隆抗體(長沙艾杰生物技術有限公司)、NOX4多克隆一抗(Santa Cruze公司)，P38 MAPK/P-p38 MAPK兔源單克隆抗體(cell signaling technology公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔或二抗(Santa Cruze公司)；Real-time quantative PCR試劑盒(廣州東盛生物技術有限公司)；優質胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 HUVECs培養HUVEC接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和10 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃、5%的CO2的培養箱內培養。細胞用0.25%的胰酶消化傳代，取長勢良好的細胞用于實驗。

1.3 MTT法檢測細胞的活力將HUVECs在DMEM培養基制成單個細胞懸液，以每孔2×103個細胞接種于96孔培養板中，并放入37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞長到50%融合時更換含0.1%血清的DMEM培養基(每孔180 μL)同步化24 h，之后分別按實驗要求分組處理。①對照組(0.1%血清的DMEM培養)，實驗組在此基礎上分別加入H2O2、AngⅡ或 CGRP處理；觀察CGRP保護作用時，CGRP預處理30 min后再加 H2O2或AngⅡ處理24 h。隨后在培養板中加入10× MTT 20 μL/孔，繼續培養4 h，棄去培養基，加入200 μLDMSO，37 ℃孵育10 min，酶聯免疫檢測儀測定在波長為570 nm時的光密度值(OD570)。

1.4流式細胞術檢測細胞周期和增殖將100 mL細胞培養瓶中的HUVEC用含0.1%血清的DMEM培養基同步化24 h，后按要求(見方法1.3)處理細胞。隨后收集細胞，PBS清洗一遍，棄上清，每組用1 mL 75%乙醇固定。樣品寄至北京中國中醫科學院基礎理論研究所檢測。

1.5 Western Blot檢測蛋白表達按實驗要求(見方法1.3)處理細胞，按照細胞漿/核/膜/結構蛋白抽屜試劑盒步驟提取細胞蛋白。按照BCA試劑盒說明用酶聯免疫檢測儀檢測OD570計算蛋白含量。將提取的細胞總蛋白的上樣緩沖液100 ℃煮5 min后冰浴，配制10%分離膠和5%積層膠，灌1.5 mm板，100 V電壓跑過積層膠后，換160 V電壓跑分離膠，將電泳總時間控制在90 min之內。然后轉膜、麗春紅染色觀察蛋白質轉移情況。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，1∶1000加入p38 MAPK、NOX4和β-actin等一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌15 min，每5 min換液1次。1 ∶2 000加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗，37 ℃孵育45 min，TBST洗滌45 min，每15 min換液1次。然后在暗室中滴加化學發光試劑激發熒光，壓片，然后顯影、定影。圖片用AlphaImager2200進行灰度掃描。

1.6 RT-PCR檢測NOX4 mRNA表達NOX4和GAPDH引物由艾杰生物公司設計，并由北京三博遠志生物公司合成。NOX4正義鏈：AACTTATGTTCCCTGGCTATC，反義鏈：TCTTGAACTCTGACCTCGT；GAPDH正義鏈：CTGCACCACCAACTGCTTAG，反義鏈：AGGTCCACCACTGACACGTT。

細胞按實驗要求處理后，提取總RNA并合成cDNA。-20 ℃長期保存。在八聯管中依次加入：第一鏈cDNA1μL、引物2 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 15 μL，ddH2O補至25 μL。熒光PCR儀上按以下步驟進行：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s、NOX4和GAPDH 50 ℃退火延伸共1 min,40個循環。最后72 ℃終延伸10 min。55 ℃到95 ℃之間每0.5 ℃為一個梯度，每個梯度延續10 s，測定引物的融解曲線。統計Ct值，根據2-ΔΔCt法表示相對定量結果。以GAPDH作為內參，根據公式ΔCt=[Ct(NOX4)]-[Ct(GAPDH)]、ΔΔCt=[ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)]，2-ΔΔCt表示實驗組NOX4相對于對照組原始拷貝數的倍數差異。

2 結 果

2.1 CGRP逆轉Ang Ⅱ或H2O2對HUVECs生長的抑制作用根據本組前期研究結果和本次結果可以看出，CGRP能劑量依賴性增加HUVECs活力(圖1A)，Ang Ⅱ或H2O2劑量依賴性地降低HUVECs活力(圖1B，1C)。按照保護或損傷有明細差異的原則，我們選擇處理細胞的劑量分別是： CGRP 100 nmol/L、H2O2500 μmol/L、Ang Ⅱ 100 nmol/L；給予CGRP分別預處理HUVEC 30 min，如圖1D所示，CGRP能使Ang Ⅱ 或H2O2損傷的HUVEC活力增加，說明CGRP具有明顯的抗氧化作用。另外，從流式細胞儀結果(表1)看，CGRP具有明顯的促進內皮細胞增殖，并對抗Ang Ⅱ 或H2O2對HUVECs的抑制增殖或損傷作用。

圖1 CGRP對Ang Ⅱ或H2O2 抑制HUVECs生長作用的影響 A、B、C 分別為 CGRP 、H2O2、Ang Ⅱ對細胞作用的量—效關系，D:CGRP(100 nmol/L) 預處理對Ang Ⅱ(100 nmol/L)或H2O2(500 μmol/L)損傷細胞的保護作用。與對照組(Control)比較，*:P<0.05，**:P<0.01；與AngⅡ比較，#:P<0.05；與 H2O2比較 +:P<0.05，(n=3)

2.2 H2O2，Ang Ⅱ通過P38 MAPK磷酸化誘導NOX4表達為了觀察Ang Ⅱ 或H2O2對氧化應激p38 MAPK信號通路的影響，用Ang Ⅱ (100 nmol/L) 或500 μmol/L H2O2以及SB 203580 (p38 MAPK磷酸化抑制劑)分別處理HUVECs 10 min，觀察p38 MAPK磷酸化水平的變化。如圖2所示，Ang Ⅱ 或H2O2能顯著增加磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)表達(A)和NOX4的蛋白表達(B)水平，給予SB 203580后，p-p38 MAPK表達顯著降低，同時，也降低了NOX4的蛋白表達。說明內源性(Ang Ⅱ)和外源性(H2O2)氧化應激均通過p38 MAPK信號通路發生作用。

2.3 CGRP對Ang Ⅱ (A)或H2O2對NOX4表達的影響如圖3所示，與對照組相比，單獨CGRPG1/G0：停留于G1/G0期(無增殖活動期)細胞的百分數；S：DNA合成期細胞的百分數；G2：DNA合成后期細胞的百分數；M：DNA分裂細胞的百分數.PI=(S+G2M)/(G1G0+S+G2M),與對照組(Control)a:P<0.01;與Ang Ⅱ 或H2O2比較，b:P<0.05

表1CGRP對ANGⅡ或H2O2引起的HUVECs周期分布的影響

組別G1/G0%S%G2/M%PI值%Control44.8±0.3543.9±0.2711.3±0.1155.2±0.35AngⅡ50.5±0.1542.6±0.427.1±0.4649.6±0.21aH2O251.0±2.640.6±2.2a8.4±0.846.8±0.45aCGRP+AngⅡ41.0±0.6147.6±0.83b11.4±0.3159.0±0.60bGRP+H2O240.8±4.245.6±4.1b10.0±1.261.1±1.3b

圖2 抑制 p38MAPK磷酸化對AngⅡ或H2O2 誘導細胞內NOX4表達的影響 A：p38MAPK磷酸化蛋白表達，B:NOX4蛋白表達；SB:SB 203580(p38 MAPK磷酸化抑制劑)；與對照組(Control)比較，*:P<0.05，與AngⅡ比較，#:P<0.01，與H2O2比較，+:P<0.01(n=3)

能明顯降低NOX4蛋白(圖3A)和mRNA(圖3B)的表達，p38 MAPK磷酸化抑制劑SB203580能取消CGRP這種抑制作用，說明CGRP是通過p38 MAPK磷酸化誘導NOX4表達增加；給細胞預孵育CGRP 30 min,再給予Ang Ⅱ 或H2O2共培養細胞24 h。 與比對照組相比，NOX4表達并沒有增加，且略有降低，結合圖2B中Ang Ⅱ 及H2O2單獨應用的結果，說明CGRP對Ang Ⅱ 或H2O2誘導的NOX4表達增加有抑制作用； CGRP加p38 MAPK磷酸化抑制劑SB203580共預孵育細胞30 min，并能進一步降低CGRP對Ang Ⅱ 或H2O2誘導的NOX4表達能力。說明CGRP對Ang Ⅱ 或H2O2誘導的NOX4表達的抑制作用可能部分通過p38 MAPK信號途徑。

圖3 CGRP對AngⅡ或H2O2誘導的NOX4表達影響 A:蛋白質表達；B：mRNA表達(n=3)，SB:SB 203580是p38 MAPK磷酸化抑制劑；與對照組(Control)比較，*：P<0.05，與CGRP比較，#:P<0.05；與CGRP+Ang Ⅱ比較，+:P<0.01；與CGRP+H2O2比較，$:P<0.05(n=3)

3 討 論

本研究發現，無論是外源性H2O2還是AngⅡ內源性刺激血管內皮細胞可能通過激活p38 MAPK磷酸化導致內源性氧化應激增加NOX4表達，導致內源性ROS增加并引起HUVEC損傷；CGRP保護HUVEC的機制可能與通過抑制p38 MAPK磷酸化水平、下調NOX4表達有關。

研究顯示，MAPK家族中的p38 MAPK信號通路主要介導細胞氧化應激損傷[11]。本實驗結果顯示，H2O2和AngⅡ能顯著升高磷酸化p38 MAPK及NOX4表達水平，可能是由于過多的AngⅡ和H2O2處理內皮細胞后引發p38 MAPK磷酸化使內源性ROS濃度升高，進而引起細胞損傷，降低內皮細胞增殖，甚至是細胞凋亡。100nmol/LCGRP干預后，能明顯下調H2O2和AngⅡ引起的磷酸化p38 MAPK水平，且給予p38 MAPK磷酸化抑制劑SB203580能抑制H2O2和AngⅡ誘導的NOX4蛋白和mRNA的表達，提示CGRP可能不是直接作用于NOX4，而可能通過抑制p38 MAPK磷酸化進而抑制NOX4表達。

總之，本實驗證明，在H2O2和AngⅡ誘導的HUVEC損傷過程中，NOX4呈激活狀態，說明NOX4與HUVEC損傷密切相關，CGRP對HUVECs的保護作用也可能與下調p38 MAPK磷酸化和進而抑制NOX4表達有關。

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Inhibitionofp38MAPK/NOX4SignalPathwayMediatestheProtectionofCGRPontheHUVECsInjuredbyOxidativeStress

OU Qilin,ZENG Siyu,LUO Jingfei,et al

(DepartmentofCardioMedicine,TheSecondAffiliatedHosptial，UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo study the protection of cacitonin gene-related peptide (CGRP) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injured by oxidative stress,and explore whether the mechanism involved in inhibition of p38MAPK/ NOX4 signal pathway.MethodsHUVECs cell line were cultured in vitro,angiotensin Ⅱ (AngⅡ) or hydrogen peroxide (H2O2) serves as the gent of oxidative stress,CGRP serves as the protection agent.MTT was used to test the viability of cells,distribution of cell cycles and proliferation of cells were observed by flow cytometry.The protein or mRNA expressions of the p38 MAPK、NADPH oxidase 4 (NOX4) was measured by Western blot or RT-PCR,respectively.RethodsCompared with control group,AngⅡ or H2O2decreased the cell viability and proliferation index (PI)dose-dependently，which were inhibited by 100 nmol/L CGRP;Meantime,the level of phosphated p38 MAPK was induced by AngⅡ or H2O2,and increased the expression of NOX4.Pretreatment with CGRP and SB 203580 can inhibit the up-regulation of NOX4 induced by AngⅡ or H2O2.ConclusionsThe protection of CGRP on the HUVECs injured by oxidative stress from in vitro(H2O2) or in vivo(AngⅡ) is related to inhibition of p38MAPK/ NOX4 signal pathway.

CGRP; oxidative stress; endothelial cell; NADPH Oxidase4

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.004

2015-05-08；

2015-06-07

廣東省醫學基金，A2014159；分子靶標新藥研究協同創新中心湘教通(2014)405號.

*通訊作者，E-mail:qinxuping@sohu.com.

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(此文編輯：秦旭平)