亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T、A1298C多態性與胃癌的關系

徐昌隆，王建嶂，鄭波，曹曙光，吳昊，薛戰雄

（溫州醫科大學附屬第二醫院 消化內科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T、A1298C多態性與胃癌的關系

徐昌隆，王建嶂，鄭波，曹曙光，吳昊，薛戰雄

（溫州醫科大學附屬第二醫院 消化內科，浙江 溫州 325027）

目的：探討亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T和A1298C基因多態性與浙江漢族人群胃癌的關系。方法：采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RELP）技術，檢測112例胃癌患者和218例正常對照者的MTHFR C677T及A1298C基因多態性分布差異。結果：MTHFR C677T的突變等位基因T及變異基因型（CT+TT）頻率在胃癌組和對照組之間均無統計學差異（34.82% vs 32.57%和53.57% vs 52.75%，均P＞0.05）。胃癌組MTHFR A1298C突變等位基因C明顯高于對照組，差異有統計學意義（21.43% vs 12.39%，P=0.006，0R=1.929，95%CI：1.325～2.873），而2組間突變基因型（AC+CC）頻率差異無統計學意義（32.15% vs 36.24%，P＞0.05）。結論：浙江漢族人群MTHFR A1298C突變等位基因C可能與胃癌的易感性有關。

亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態性；胃腫瘤

亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝途徑的關鍵酶之一。MTHFR基因有兩個常見多態，即C677T及A1298C，其基因多態性最常見的改變是677C→T和 1298A→C的突變。這些突變使其編碼的MTHFR蛋白熱不穩性及酶活性下降，導致總葉酸水平降低，與包括胃癌在內的多種惡性腫瘤的發生有關[1-2]。國內外有較多報道MTHFR基因多態性與胃癌關系的文獻[3-4]，但結論頗不一致。本研究運用現代分子生物學實驗技術，在浙江漢族人群中探討MTHFR基因C677T及A1298C兩個單核苷酸位點的多態性與胃癌的關系，并分析眾多研究結論迥異的可能原因。

1 對象和方法

1.1 研究對象 2011年5月至2014年7月，在溫州醫科大學附屬第二醫院消化內科收集112例原發性胃癌患者為胃癌組，經臨床、實驗室、電子胃鏡及病理組織學確診，其中男74例，女38例，年齡（59.2±12.8）歲。同期在溫州醫科大學附屬第二醫院體檢中心收集的218例健康體檢者為對照組，其中男147例，女71例，年齡（61±13.2）歲。胃癌組和對照組在性別、年齡構成上差異均無統計學意義（均P＞0.05）。以上研究對象均為無血緣關系的浙江漢族人群。所有入選對象均簽署知情同意書，研究取得醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取：取空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝。采用蛋白酶K消化，苯酚/氯仿/異戊醇法提取全基因組DNA（試劑盒購自上海捷瑞生物有限公司，按照說明書操作）。經DNA定量儀測定后于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計和合成：參照文獻[5-6] 設計引物，MTHFR C677T引物序列：正義鏈5’-TGAAGGAGAAGGTGT CTGCGGGA-3’，反義鏈5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’；MTHFR A1298C引物序列：正義鏈5’-CTTTGGGGAGCTGA AGGACTACTAC-3’，反義鏈5’-CACTTTGTGACCATTCCGGTT TG-3’。由上海生物工程有限公司合成。

1.2.3 MTHFR C677T、A1298C基因多態性檢測：采用限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RELP）PCR法檢測MTHFR C677T和A1298C基因多態性。①C677T擴增體系與基 因多態性分析：PCR反應體系50μL，含正反義鏈引物 （10 pmol/L）各1.5μL，MgCl2（25 mmol/L）3μL，dNTPs（10 mmol/L）2μL，10×buffer 5μL，Taq酶 2.5 U（1 U/μL），模板DNA 2μL（約20～40 ng/μL）， 滅菌雙蒸水32.5μL。反應條件：94 ℃預變性5 min； 94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個 循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物用Hinf I（MBI Fermentas，USA）37 ℃酶切過夜，再用10%聚丙烯酰 胺凝膠電泳（PAGE）檢測。②A1298C擴增體系與基因多態性分析：PCR反應體系25μL，含正反義鏈引物（10 pmol/L）各1μL，MgCl2（25 mmol/L）2μL，dNTPs（10 mmol/L）1μL，10×buffer 2μL，Taq酶 1 U（1 U/μL），模板DNA 1μL（約20～40 ng/μL），滅菌雙蒸水16μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個 循環；72 ℃延伸7 min。擴增產物加Mbo I I（MBI Fermentas，USA）37 ℃酶切過夜，用12% PAGE檢測。

1.3 統計學處理方法 所有數據采用SPSS13.0統計軟件處理。Hardy-Weinberg平衡規律使用卡方檢驗，分類變量運用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，以比值比（OR）及95%可信區間（CI）表示相對危險度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR C677T、A1298C基因位點 MTHFR C677T正常等位基因C對應198 bp 1條帶，突變等位基因T為175、23 bp 2條帶，其中23 bp條帶泳出膠外，故以198 bp為CC基因型，175 bp為TT基因型，CT基因型有198 bp與175 bp 2條片段帶，見圖1。MTHFR A1298C正常等位基因A對應56、31、30、28和18 bp， 突變等位基因C對應84、31、30和18 bp，電泳時31、30、28和18 bp片段帶泳出膠外，故分別判56 bp 為AA型、84 bp為CC型、有56 bp和84 bp 2條片段帶為AC型，見圖2。上述基因位點的部分PCR產物經測序后作為陽性對照，以輔助判斷基因型（上海浦生生物技術有限公司），見圖3-4。

圖1 MTHFR C677T酶切產物電泳圖

圖2 MTHFR A1298C酶切產物電泳圖

圖3 MTHFR C677T測序圖

圖4 MTHFR A1298C 測序圖

2.2 MTHFR C677T基因型和等位基因在胃癌組和對照組的分布 胃癌組和對照組MTHFR C677T基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡規律（P＞0.05），樣本具有群體代表性。MTHFR C677T的突變等位基因T及變異基因型（CT+TT）頻率在胃癌組和對照組之間差異均無統計學意義（分別為34.82% vs 32.57%，P=0.363，OR=1.106，95%CI：0.763～1.158； 53.57% vs 52.75%，P=0.654，OR=1.033，95%CI：0.812～1.237），見表1。

2.3 MTHFR A1298C基因型和等位基因在胃癌組和對照組中的分布 胃癌組和對照組MTHFR A1298C基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡規律（P＞0.05），樣本具有群體代表性。胃癌組MTHFR A1298C突變等位基因C明顯高于對照組，差異有統計學意義 （21.43% vs 12.39%，P=0.006，OR=1.929，95%CI：1.325～2.873）。而2組間突變基因型（AC+CC）頻率差異無統計學意義（32.15% vs 36.24%，P=0.762，OR=0.834，95%CI：0.786～2.115），見表2。

表1 MTHFR C677T基因多態性在胃癌組和對照組中的分布 n（%）

表2 MTHFR A1298C基因多態性在胃癌組和對照組中的分布 n（%）

3 討論

MTHFR能催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸。MTHFR編碼基因位于染色體1p36.3，存在多個單核苷酸多態性位點。其中C677T多態性位于MTHFR基因第4外顯子，該位點胞嘧啶（C）突變為胸腺嘧啶（T）后，使MTHFR的熱不穩定性增加，導致該酶活性降低。A1298C位于MTHFR基因第7外顯子，該位點發生A→C突變后，引起MTHFR催化活性降低。體外基因表達研究發現，攜帶677TT純合子基因型、1298AC雜合子基因型以及（677CT+1298AC）復合雜合子基因型的個體，其體內MTHFR酶活性分別降低45%，68%和41%[7]。近期有報道，677CT和677TT變異基因型頻率較高人群的血清葉酸濃度顯著降低[8]。因此，這些突變引起的血漿葉酸水平降低，可通過破壞DNA甲基化、合成和修復發揮致癌作用，增加包括胃癌在內的多種腫瘤發生的危險性。

本研究顯示，胃癌組與對照組之間突變基因型（AC+CC）頻率差異無統計學意義，而胃癌患者MTHFR A1298C位點突變等位基因C的頻率明顯高于對照組，提示MTHFR Al298C可能是浙江漢族人群胃癌的易感基因。在相關Meta分析[4，9-10]中，雖均顯示胃癌患者與健康對照之間MTHFR A1298C的突變基因型（AC+ CC）頻率差異無統計學意義，但其中Lv等[9]和Dong 等[10]還顯現兩人群間突變等位基因C差異亦無統計學意義，故皆認為A1298C基因多態性與胃癌的發生無關，與本研究的結果有異。本研究顯示的MTHFR C677T的突變等位基因T及變異基因型（CT+TT）頻 率在胃癌組和對照組之間差異均無統計學意義，與翁玉蓉等[11]的報道相同，可表明MTHFR C677T多態性與胃癌的發生無明顯關聯。但是與此結論相反的，包括相關Meta分析的報道[1，3，9-10，12]頗多，都明確提示攜帶MTHFR 677 CT和677 TT基因型以及T等位基因的個體顯著增加胃癌的易感性。經查閱文獻還發現有與前述皆迥異的報道，如MTHFR C677T和A1298C多態性均與胃癌的發生無關[13]，以及MTHFR 677 TT基因型和MTHFR 1298 CC基因型都能顯著降低患癌癥風險[14]。

綜上，可以看出MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因多態性與胃癌易感性關系的結論差異很大，甚至不少是相互矛盾的。由于這些不一致的結果來自不同種族、不同地區、不同方法的獨立研究，Meta分析也只是表達了這些相同目的的多個獨立研究結果的合并效應量。故諸多研究結果的差異，似可主要歸因于種族差異、研究方法不同、地域相異或某些研究還有對象樣本量不夠大所致。此外，尤其值得考慮的是MTHFR基因突變致癌是通過降低血漿葉酸水平而起作用的，研究對象個體的葉酸狀態（包括葉酸攝入，血漿、血細胞和組織的葉酸含量）很有可能是造成上述結果矛盾的重要原因。可能是基于這種想法，新近有研究將葉酸攝入量作為條件來研究MTHFR基因多態性與胃癌的關系，結果表明MTHFR 677 TT突變基因型和高葉酸攝入量對制約胃癌有保護作用[15]。

[1] Xia LZ,Liu Y,Xu XZ,et a1.Methylenetetrahydrofolate re-ductase C677T and A1298C polymorphisms and gastric can-cer susceptibility[J] .World J Gastroenterol,2014,20(32): 11429-11438.

[2] Ekiz F,Ormeci N,Coban S,et al.Association of methylene-tetrahydrofolate reductase C677T-A1298C polymorphisms with risk for esophageal adenocarcinoma,Barrett’s esoph-agus,and reflux esophagitis[J] .Dis Esophagus,2012,25(5): 437-441.

[3] Boccia S,Hung R,Ricciardi G,et al.Meta-and pooled analyses of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C polymorphisms and gastric cancer risk: a huge-GSEC review[J] .Am J Epidemiol,2008,167(5): 505-516.

[4] 孫良,孫業桓,曹紅院,等.亞甲基四氫葉酸還原酶(MTH-FR)基因多態性與胃癌易感性的Meta分析[J] .現代預防醫學,2008,35(15): 2846-2849.

[5] Coppedè F,Marini G,Bargagna S,et al.Folate gene poly-morphisms and the risk of Down syndrome pregnancies in young Italian women[J] .Am J Med Genet A,2006,140(10): 1083-1091.

[6] Laraqui A,Allami A,Carrié A,et al.Relation between plasma homocysteine gene polymorphisms of homocysteine metab-olism-related enzymes,and angiographically proven coro-nary artery disease[J] .Eur J Intern Med,2007,18(6): 474-483.

[7] Weisberg IS,Jacques PF,Selhub J,et al.The 1298A→C polymorphism in methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR): in vitro expression and association with homo-cysteine[J] .Atherosclerosis,2001,156(2): 409-415.

[8] Zappacosta B,Graziano M,Persichilli S,et a1.5,10-Methy-lenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T and A1298C polymorphisms: genotype frequency and association with homocysteine and folate levels inmiddle-southern Italian adults[J] .Cell Biochem Funct,2014,32(1): 1-4.

[9] Lv L,Wang P,Sun B,et al.The polymorphism of methy-lenetetrahydrofolate reductase C677T but not A1298C con-tributes to gastric cancer[J] .Tumour Biol,2014,35(1): 227-237.

[10] Dong X,Wu J,Liang P,et al.Methylenetetrahydrofolate re-ductase C677T and A1298C polymorphisms and gastric can-cer: a meta-analysis[J] .Arch Med Res,2010,41(2): 125-133.

[11] 翁玉蓉,房靜遠,孫丹鳳,等.胃癌組織中葉酸水平與代謝酶亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性的關系研究[J] .中華消化雜志,2006,26(1): 26-30.

[12] Song B,Ai J,Kong X,et al.Aberrant DNA Methylation of P16,MGMT,and hMLH1 Genes in Combination with MTHFR C677T Genetic Polymorphism in gastric cancer[J] .Pak J Med Sci,2013,29(6): 1338-1343.

[13] Kim JK,Kim S,Han JH,et al.Polymorphisms of 5,10-meth-ylenetetrahydrofolate reductase and risk of stomach can-cer in a Korean population[J] .Anticancer Res,2005,25(3B): 2249-2252.

[14] Lin J,Zeng RM,Li RN,et al.Aberrant DNA methylation of the P16,MGMT,and hMLH1 genes in combination with the methylenetetrahydrofolate reductase C677T genetic poly-morphism and folate intake in gastric cancer[J] .Genet Mol Res,2014,13(1): 2060-2068.

[15] Chen J,Yuan L,Duan YQ,et al.Impact of methylenetetrahy-drofolate reductase polymorphisms and folate intake on the risk of gastric cancer and their association with Helicobacter pylori infection and tumor site[J] .Genet Mol Res,2014,13 (4): 9718-9726.

（本文編輯：吳健敏）

Relationship between the methylenetetrahydrofolate reductase C677T,A1298C genetic polymorphisms and gastric cancer

XU Changlong,WANG Jianzhang,ZHENG Bo,CAO Shuguang,WU Hao,XUE Zhanxiong.
Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To evaluate the association between methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T,A1298C genetic polymorphisms and gastric cancer in Zhejiang Han nationality population.Methods:Select 112 cases of patients with gastric cancer,choose health check-up 218 cases as controls.The genetic polymorphisms of MTHFR (C677T and A1298C) were detected by PCR-RELP method.Results:There were no significant discrepancies of the mutational allele T and variant genotype (CT+TT) frequencies in the MTHFR C677T gene between the gastric cancer patients and the controls (34.82% vs 32.57% and 53.57% vs 52.75%,respectively,all P＞0.05).The frequency of mutational allele C in MTHFR A1298C gene was significantly higher in gastric cancer patients than that in the controls (21.43% vs 12.39%,P=0.006,OR=1.929,95%CI: 1.325～2.873).However,there were no significant discrepancies of the variant genotype frequencies (AC+CC) between the two groups (32.15% vs 36.24%,P＞0.05).Conclusion:The mutational allele C in MTHFR A1298C gene may be associated with the susceptibility to gastric cancer in Zhejiang Han nationality population.

methylenetetrahydrofolate reductase; genetic polymorphism; gastric neoplasms

R735.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.005

2015-01-03

溫州市科技計劃資助項目（Y20110132）

徐昌隆（1976-），男，浙江溫州人，副主任醫師，博士。

薛戰雄，主任醫師，Email：xuezhanxiong@163.com。