芪冬活血飲對急性肺損傷大鼠TLR4/NF-κB炎癥信號通路的影響

洪輝華，楊珺超，高潤娣，趙瑋，朱淵紅，蔡宛如

（1．浙江中醫藥大學附屬第一醫院 呼吸科，浙江 杭州 310006；2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院 呼吸科，浙江 杭州 310005）

·論 著·

芪冬活血飲對急性肺損傷大鼠TLR4/NF-κB炎癥信號通路的影響

洪輝華1，楊珺超1，高潤娣1，趙瑋1，朱淵紅1，蔡宛如2

（1．浙江中醫藥大學附屬第一醫院 呼吸科，浙江 杭州 310006；2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院 呼吸科，浙江 杭州 310005）

目的：通過觀察芪冬活血飲對脂多糖所致大鼠急性肺損傷（ALI）的干預作用，明確芪冬活血飲的保護作用并探討其作用機制。方法：將50只SD大鼠隨機分為空白組，模型組，高、中、低劑量中藥治療組5組。氣道內滴注脂多糖建立急性肺損傷模型。中藥治療組以芪冬活血飲灌胃，空白組及模型組以0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組大鼠造模后24 h處死，收集標本。結果：①芪冬活血飲可以減輕肺損傷大鼠肺泡結構破壞，肺水腫及炎性細胞浸潤。②ALI大鼠肺泡灌洗液腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-10水平增高，芪冬活血飲降低TNF-α、IL-1β水平，升高IL-10水平，高劑量組與低劑量組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。③ALI大鼠Toll樣受體-4（TLR4）、核轉錄因子-κB（NF-κB）p65蛋白及mRNA表達增加，芪冬活血飲可減少TLR4、NF-κB p65蛋白及mRNA表達，并有一定的劑量相關性。結論：芪冬活血飲對LPS誘導的大鼠ALI有保護作用，其機制與抑制TLR4/NF-κB p65炎癥信號通路，降低促炎細胞因子TNF-α、IL-1β水平，升高抗炎細胞因子IL-10水平有關。

急性肺損傷；Toll樣受體-4；核轉錄因子κB；細胞因子

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）是一種呼吸系統急危重癥，是指由心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性、進行性低氧性呼吸衰竭。目前認為腫瘤壞死因子-α（tumornecrosis factor-alpha，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、一氧化氮（nitric oxide，NO）等促炎癥遞質大量釋放，IL-10、IL-13等抗炎遞質分泌相對不足，導致體內促炎/抗炎遞質嚴重失衡是ALI發生發展的主要機制［1-2］。

TLR4/NF-κB炎癥信號通路對ALI促炎/抗炎遞質平衡起關鍵的調控作用。炎癥反應的本質是宿主識別外界致炎信號并進行適應性應答的過程。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是免疫細胞識別病原微生物致炎組分，啟動炎癥反應的重要模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），其中脂多糖（lipoplolysaccharide，LPS）所致的炎癥反應主要由TLR4負責識別。TLR4與LPS結合后，經可通過多種途徑調控核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化，活化的NF-κB上調TNF-α、IL-1β、IL-8等促炎細胞因子的表達，致使體內炎癥失衡最終導致ALI發生發展[3-5]。

在中醫理論和實踐上，ALI屬于熱毒瘀結、氣陰兩虛病癥，課題組在清熱解毒、祛瘀通腑、益氣養陰為主的治療原則上，采用黃芪、麥冬、虎杖、當歸等藥物組成“芪冬活血飲”，前期研究已經證實“芪冬活血飲”能減少促炎癥遞質TNF-α、內皮素-1、肺表面活性蛋白A分泌，增加抗炎遞質IL-10分泌，糾正促炎/抗炎遞質失衡，對ALI大鼠具有良好的保護作用[6-9]。然而，芪冬活血飲調控炎癥遞質釋放的機制尚不明確。

本研究擬觀察芪冬活血飲對ALI大鼠肺組織TLR4、NF-κB p65蛋白及mRNA和肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-10水平的影響，明確芪冬活血飲對TLR4/ NF-κB炎癥信號通路的影響，探討其調控炎癥反應的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠50只，清潔級，體 質量（200±20）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2 供試藥品 芪冬活血飲（黃芪20 g、麥冬12 g、虎杖20 g、當歸12 g）藥材由浙江省中醫院中藥房提供，由浙江中醫藥大學制劑室制成質量體積比1:1湯劑，滅菌處理后，-4 ℃低溫保存備用。

1.3 主要試劑 LPS（coli 055:B5）（批號：L2880）購自Sigma公司。大鼠TNF-α ELISA試劑盒（批號： RT20135528B）、大鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號： RT20138526B）、大鼠IL-10 ELISA試劑盒（批號：RT20131025B）購自RND公司。免疫組織化學二步法Envision試劑盒（批號：26F1779A）購自DAKO公司，NF-κB p65免疫組織化學試劑盒（批號：SC-372G211）、TLR4免疫組織化學試劑盒（批號：SC-30002A2510）、DAB顯色液（批號：08M1779A）均購自santacruz公司。Trizol Reagent（批號：40950732） 購自Bio Basic公司；RTPCR定量試劑盒（批號：DRR041A），cDNA合成反轉錄試劑盒（批號：CK101D）， DNA Marker（批號：DL 2000）均購自TAKARA公司。

1.4 主要儀器 石蠟切片機（德國Leica公司HM 340E型），酶標分析儀（北京朗普新技術有限公司DNM-9602型），熒光顯微鏡攝像機（日本OLYMPUS公司BX20型），定量PCR儀器（美國ROCHE公司ABI 7500型），臺式高速冷凍離心機（Eppendorf公司Certrifuge 5417R型），電泳系統（Bio-RAD公司 Mini-Proten Tetra System型），凝膠成像儀（Bio-RAD公司ChemiDoc XRS+System型）。

1.5 模型建立 各組大鼠均經異氟烷霧化麻醉，在距大鼠環狀軟骨約0.5 cm處作大小約0.3 cm切口，分離至氣管；將LPS配置成3 mg/mL溶液，經針筒按照1.5 mg/kg劑量緩慢注入大鼠氣管中，然后將大鼠左右上下搖晃，使LPS均勻分布于肺組織中。空白組采用等量0.9%氯化鈉溶液氣管內滴注。

1.6 實驗分組及給藥 健康雄性SD大鼠50只按隨機數字表法分成5組，即空白組，模型組，低、中、高劑量芪冬活血飲治療組（簡稱低、中、高劑量組），每組10只。低、中、高劑量組造模前24、12 h及造模后12 h分別以4、8和16 mL/kg芪冬活血飲灌胃，模型組和對照組各時間點以8 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液灌胃。造模后24 h腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠（劑量為3 mL/kg），處死動物采集標本。

1.7 肺泡灌洗液 暴露頸部氣管及兩肺，左肺用于肺泡灌洗。結扎右主支氣管，經由頸部氣管插入5.5號靜脈注射針至左主支氣管，用無菌手術縫合線由氣管食管間隙綁扎氣管及靜脈注射針，使其固定并密封。注射針接5 mL針筒注入3 mL 0.9%氯化鈉溶液見左肺膨起，輕輕按摩左肺30 s，再用20 mL 針筒緩慢回抽，反復3次，回收率在50%以上。回收液分裝入離心管中，低速離心機3 000 r/min離心15 min，上清液-80 ℃冰箱保存備用。ELISA法測TNF-α、IL-1β、IL-10水平。操作參照說明書。

1.8 肺組織 開胸取右肺，取右下肺置痰杯-80 ℃冰箱保存PCR測定用。余肺中性緩沖甲醛（pH 7.4）固定24 h后，石蠟包埋切片。其中各組取2只用于HE染色，剩余大鼠肺組織行免疫組織化學檢測。

①經常規HE染色，光鏡下觀察各組肺組織病理變化。

②以免疫組織化學二步法檢測肺組織TLR4、NF-κB p65的蛋白表達，在細胞漿內或細胞核內出現黃、棕色顆粒為陽性細胞。并參照文獻[10] 計算免疫組織化學積分：將陽性細胞按染色強度打分，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分（染色深淺需與背景比較）；再將陽性細胞所占的百分比打分，0分為陰性，1分為陽性細胞小于等于10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為大于75%；兩者的乘積為免疫組織化學表達積分。

③RT-PCR法檢測肺組織TLR4、NF-κB p65mRNA表達。肺組織液氮保存，采用Trizol一步法試劑盒 提取肺組織細胞總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA純度、完整性，紫外分光光度儀定量后，取總RNA 反轉錄為cDNA。根據美國NCBI數據庫提供的mRNA全基因序列，采用Primer 5.0引物設計軟件和引物設計原則進行PCR引物的設計，由上海生物工程有限公司合成。引物序列：cav-1的上游引物為5’-GATT GCTCAGACATGGCAGTTTC-3’，下游引物為5’-CACTCGAGG TAGGTGTTTCTGCTAA-3’，擴增片段長度135 bp；NF-κB p65上游引物為5’-GGACTGCCGGGATGGCTTCTAT-3’，下游引物為5’-GCTTGCTCCAGGTCTCGCTTCTT-3’，擴增片段長度108 bp；18-s的上游引物為5’-GAATTCCCAGT AAGTGCGGGTCATA-3’，下游引物為5’-CGAGGGCCTC ACTAAACCATC-3’，擴增片段長度為105 bp。進行PCR 反應。電泳分離、顯色成像。以DNA maker為標準， Marker為TAKARA DL 2000，根據擴增產物片段大小來鑒定目的基因片段，以18-s光度值為內參考，以待測基因與18-s的比值為待測基因的相對表達量，目的基因的相對表達水平以相對表達量（2-△Ct× 104）進行分析。PCR反應條件：95 ℃，1 min；40個循環：95 ℃，10 s；64 ℃，25 s（收集熒光）。

1.9 統計學處理方法 模型組大鼠有2只在實驗結束前死亡，統計處理時去除各組與模型組相同編號大鼠數據。采用SPSS17.0統計軟件。所有數據以±s表示，計量資料各組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理學比較 空白組大鼠肺呈均勻淡粉紅色，包膜光滑，彈性好，表面未見病損灶；光鏡下肺組織結構完整，肺泡結構清晰，肺泡間隔無水腫，肺泡腔內未見水腫液，偶見肺間質白細胞少量浸潤。模型組大鼠肺體積顯著增大，呈暗紅色，包膜下充血水腫明顯，彈性降低，表明可見斑片出血；光鏡下肺泡結構破壞，肺泡內廣泛積液水腫，肺泡間隔增厚，肺泡變小伴出血。各劑量治療組肺包膜下充血水腫均較模型組減輕，鏡下肺泡結構不同程度破壞，肺泡內有炎癥細胞浸潤，但程度均輕于模型組。見圖1。

圖1 各組肺組織HE病理圖片（HE，×100）

2.2 各組大鼠肺泡灌洗液細胞因子比較 空白組TNF-α、IL-1β、IL-10含量均最低，與其余各組比較差異均有顯著統計學意義（P＜0.01）。模型組TNF-α、IL-1β含量最高，而IL-10含量均低于各治療組；和低劑量組比較差異均無統計學意義，與中劑量組、高劑量組比較差異均有統計學意義。見表1。

三治療組TNF-α、IL-1β含量比較，低劑量組最高，高劑量組最低。高劑量組與其余兩組比較差異有統計學意義，低劑量組與中劑量組比較差異無統計學意義。三治療組中IL-10含量低劑量組最低，高劑量組最高。低劑量組與中、高劑量組比較差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；中、高劑量組間比較差異無統計學意義（見表1）。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液細胞因子比較（n=8，±s，pg/mL）

表1 各組大鼠肺泡灌洗液細胞因子比較（n=8，±s，pg/mL）

與空白組比：aP＜0.01；與模型組比：bP＜0.01，cP＜0.05；與高劑量組比：dP＜0.01，eP＜0.05；與中劑量組比：fP＜0.01

2.3 各組大鼠免疫組織化學TLR4、NF-κB p65蛋白表達及積分比較 空白組可見少許肺泡上皮細胞及氣道上皮細胞NF-κB p65陽性表達，但染色程度低，其余細胞未見表達；模型組及各劑量組NF-κB p65陽性細胞廣泛分布在氣道黏膜上皮細胞、血管內皮細胞、浸潤的中性粒細胞及巨噬細胞等炎癥細胞中，在炎性細胞胞漿和細胞核內均有明顯表達，各劑量組NF-κB p65陽性細胞染色程度及陽性細胞百分比均低于模型組，其中高劑量組低于低劑量組。見圖2。

圖2 各組肺組織NF-κB p65蛋白表達情況（Envision，×200）

空白組可見少許血管內皮細胞及肺泡上皮細胞TLR4陽性表達，染色程度低，其余細胞基本未見表達；模型組和各劑量組TLR4主要表達在血管內皮細胞、肺泡上皮及少量的炎癥細胞上，模型組表達程度較NF-κB p65低，但染色程度及陽性細胞比例仍明顯高于其余各組；高劑量組低于低劑量組。見圖3。

圖3 各組肺組織TLR4蛋白表達情況（Envision，×200）

免疫組織化學TLR4、NF-κB p65積分：均為空白組最低，模型組含量最高。空白組和其余各組比較差異均有顯著統計學意義（P＜0.01）；模型組NF-κB p65積分和低劑量組比較差異無統計學意義，與中、高劑量組比較差異均有顯著統計學意義（P＜ 0.01）；模型組TLR4積分與中、低劑量組比較差異無統計學意義，與高劑量組比較差異有統計學意義（P=0.026）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織免疫組織化學積分比較（n=6，±s）

表2 各組大鼠肺組織免疫組織化學積分比較（n=6，±s）

與空白組比：aP＜0.01；與模型組比：bP＜0.01，cP＜0.05；與高劑量組比：dP＜0.01

高、中、低劑量組間TLR4、NF-κB p65積分比較，均為低劑量組最高，高劑量組最低。三組間比較，除NF-κB p65積分低、高劑量組比較差異有統計學意義（P＜0.01），余兩兩比較差異均無統計學意義。見表2。

2.4 各組大鼠TLR4、NF-κB p65 mRNA相對表達量比較 TLR4、NF-κB p65 mRNA相對表達量均為空白組最低，模型組最高。TLR4空白組和其余各組比較差異均有顯著統計學意義，模型組和中、高劑量芪冬活血飲組比較差異有統計學意義（P＜0.01），模型組與低劑量芪冬活血飲組比較差異無統計學意義。NF-κB p65模型組和其余各組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。NF-κB p65空白組和中、高劑量組比較差異無統計學意義，與低劑量組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

高、中、低劑量組間TLR4、NF-κB p65 mRNA相對表達量比較，低劑量組最高，高劑量組最低。三組間比較，低劑量組與中、高劑量組比較差異有統計學意義，高劑量組與中劑量組比較差異無統計學意義。見圖4、表3。

圖4 各組肺組織mRNA表達結果

表3 各組大鼠肺組織mRNA相對表達量比較（n=8，±s 2-△Ct× 104）

表3 各組大鼠肺組織mRNA相對表達量比較（n=8，±s 2-△Ct× 104）

與空白組比：aP＜0.01；與模型組比：bP＜0.01；與高劑量組比：dP＜0.01，eP＜0.05；與中劑量組比：fP＜0.01，gP＜0.05

3 討論

ALI/ARDS是一種呼吸系統急危重癥，以肺微血管通透性增加引發的彌漫性肺間質和肺泡腔水腫及炎性細胞浸潤為主要病理改變[1]。模型組大鼠肺泡結構破壞，肺泡內廣泛積液水腫伴出血，大量炎癥細胞浸潤，各芪冬活血飲治療組損傷程度均有不同程度的減輕，其中以高劑量組效果最為明顯。這表明采用LPS氣道內滴注方法復制大鼠肺損傷模型成功，芪冬活血飲對其有保護作用，且劑量越高保護作用越強。

革蘭陰性桿菌感染釋放的LPS是導致ALI的最主要原因[11]。進入體內的LPS被PRRs識別并實現炎 癥信號傳導，導致TNF-α、IL-1β、NO等促炎遞質大量 分泌，IL-10、IL-13等抗炎遞質分泌相對不足，致使 體內促炎/抗炎遞質失衡是ALI發生發展的關鍵環節。其中TNF-α起關鍵作用，IL-1β起協同作用。TNF-α可刺激巨噬細胞、內皮細胞等效應細胞大量分 泌IL-1β、IL-8等促炎細胞因子及血小板激活因子、 前列腺素、NO等次級炎癥遞質；而IL-1β可增強組織 細胞對TNF-α的敏感性，并刺激TNF-α、IL-8、E-選擇素、P-選擇素等其他炎癥遞質合成分泌[2，12-13]。兩者相互促進，啟動炎癥級聯反應導致AIL/ARDS。而LPS在刺激TNF-α、IL-1β等促炎遞質分泌同時，也刺激IL-10、IL-4等抗炎遞質的分泌。IL-10是體內重要的抗炎遞質，可直接抑制TNF-α和IL-1β的合成分泌及過度激活重建體內炎癥遞質及抗炎遞質的平衡[14]。

TLR4/NF-κB通路是啟動細胞內炎癥信號傳導的經典通路，在LPS所致的急性肺損傷中起著重要作用。目前已經明確TLR4是識別LPS并介導其炎癥信號傳導的最主要的PRRs。TLR4與LPS結合后，主要經由髓樣分化因子88（mycloid differentiation factor 88，MyD88）途徑逐級傳遞信號至腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNF receptor-associated factor-6 TRAF6），活化后的TRAF6與下游轉化生長因 子-β激活激酶1[transforming growth factor-β （TGF-β）activated kinase-1 TAK1] 、TAK1結合蛋白1、2、3（TAK1-binding protein TAB）形成復合物，磷酸化NF-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB），導致IκB降解激活NF-κB[3-4，15-16]。通常所說的NF-κB是指在NF-κB/Rel家族成員中具有主要生物活性的p50/p65異源二聚體，激活后的NF-κB迅速移位至細胞核內，大量上調IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等促炎細胞因子大量表達[5]。

各治療組TNF-α、IL-1β較模型組低，IL-10較模型組高，表明芪冬活血飲既能降低TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子水平，又能增加抗炎細胞因子IL-10水平，從而減輕肺組織損傷。再次證實芪冬活血飲能調控ALI大鼠促炎/抗炎遞質平衡，對肺損傷大鼠具有保護作用[6-9]。三治療組間比較，高劑量組與低劑量組比較差異均有統計學意義，表明隨劑量的增加，其調控炎癥遞質平衡作用增強。

模型組TLR4、NF-κB p65蛋白及mRNA表達均較空白組增加，且差異均有顯著統計學意義，提示LPS可明顯刺激ALI大鼠肺組織TLR4、NF-κB p65蛋白及mRNA表達。TLR4、NF-κB p65免疫組織化學積分模型組與高劑量組比較差異均有統計學意義，而與低劑量組比較差異無統計學意義，提示隨劑量增加芪冬活血飲降低ALI大鼠TLR4、NF-κB p65蛋白表達作用增強。TLR4、NF-κB p65mRNA表達中、高劑量組與模型組差異均有顯著統計學意義，表明中高劑量芪冬活血飲均能明顯抑制TLR4、NF-κB p65mRNA表達，兩者比較差異無統計學意義，與低劑量組比較差異均有統計學意義，提示在中、低劑量后芪冬活血飲抑制TLR4、NF-κB p65mRNA表達的作用隨劑量增加而增強，但中等劑量后其作用程度并不隨劑量增加而增強。

以上結果表明芪冬活血飲對LPS誘導的大鼠ALI有保護作用，其機制與抑制TLR4/NF-κB p65炎癥信號通路，降低促炎細胞因子TNF-α、IL-1β水平，升高抗炎細胞因子IL-10水平糾正炎癥失衡有關。

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（本文編輯：吳健敏）

The effect of Qidong Huoxue Decoction on TLR4/NF-κB inflammatory signaling pathway in acute lung in- jury rats

HONG Huihua1,YANG Junchao1,GAO Rundi1,ZHAO Wei1,ZHU Yuanhong1,CAI Wanru2.
1.De- partment of Respiration,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,310006; 2.Department of Respiration,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,310005

Objective:To investigate the protective effect of qidonghuoxue decoction (QD) on acute lung injury (ALI) in rats induced by lipopolysaccharide (LPS),and to explore the mechanism.Methods:Fifty SD rats were divided into five groups randomly: control group,model group,high-dose QD group,medium-dose QD group,low-dose QD group.The ALI model was established by intratracheal instillation of LPS.QD was administrated via esophagus to rats in QD groups; NS was substitution in control and model groups.All rats were executed 24 h after modeling,bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue were collected.Results:①HE staining showed that QD could reduce alveolar damage,pulmonary edema and inflammatory cells infiltration in rats with ALI.②TNF-α,IL-1β,IL-10 levels were increased in rats with ALI,QD decreased the levels of TNF-α and IL-1β,increased the level of IL-10,there was significant difference between the high-dose and lowdose group (P＜0.01).③The protein and mRNA expression of TLR4/NF-κB p65 both increased in rats with ALI,while QD reduced the expression,and the effect was kind of dose-related.Conclusion:QD has a protective effect on ALI induced by LPS in rats,its mechanism is related to inhibit TLR4/NF-kB p65 signaling pathway,decrease IL-1β/TNF-α levels and increase IL-10 level.

acute lung injury; Toll-like receptor 4; nuclear factor-κB; cytokines

R363

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.004

2014-09-11

國家自然科學基金資助項目（81273678）；浙江省自然科學基金資助項目（LQ12H29003）。

洪輝華（1982-），男，浙江蒼南人，主治醫師，博士。