阿托伐他汀對低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠IL-17a、LP-PLA2表達的影響

倪云杰，林振浩，侯良磊，吳漪皓，宋麗娟，胡歡歡，黃曉燕，楊德業，

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 心內科，浙江 溫州 325015；2.杭州師范大學附屬醫院 心內科，浙江 杭州 310015）

·論 著·

阿托伐他汀對低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠IL-17a、LP-PLA2表達的影響

倪云杰1，林振浩1，侯良磊1，吳漪皓1，宋麗娟1，胡歡歡1，黃曉燕2，楊德業1，2

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 心內科，浙江 溫州 325015；2.杭州師范大學附屬醫院 心內科，浙江 杭州 310015）

目的：探討阿托伐他汀對低密度脂蛋白受體基因敲除（LDLR-/-）小鼠白介素-17a（IL-17a）、脂蛋白相關磷脂酶A2（LP-PLA2）表達的影響。方法：取18只8周齡雄性LDLR-/-小鼠，12只給予高脂飲食（高脂飲食組）用于建立動脈粥樣硬化模型，6只給予普通飲食作為普食對照組。8周后，將高脂飲食小鼠隨機分成2組：高脂對照組（n=6）和治療組（n=6，阿托伐他汀60 mg·kg-1·d-1灌胃），繼續給予高脂飲食。8周后處死小鼠，全自動生化儀測血清血脂水平，HE染色觀察斑塊形態，qRT-PCR測主動脈中IL-17a和LP-PLA2的mRNA表達，免疫組織化學法測斑塊中IL-17a的表達，Western blot法測主動脈中LP-PLA2的表達。結果：高脂對照組血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）含量均明顯高于普食對照組（均P＜0.05），甘油三酯（TG）含量兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。治療組與高脂對照組相比，血清TC、LDL含量明顯降低（均P＜0.05），TG含量兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。高脂對照組小鼠主動脈組織內可見明顯動脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊內IL-17a的平均吸光度值（MA）高于普食對照組（P＜0.05）。治療組與高脂對照組相比，斑塊明顯減少，斑塊內IL-17a的MA也明顯降低（P＜0.05）。高脂對照組主動脈IL-17a和LP-PLA2的mRNA表達以及LP-PLA2蛋白的表達均高于普食對照組（均P＜0.05）。治療組與高脂對照組相比，主動脈IL-17a和LP-PLA2的mRNA以及LP-PLA2蛋白的表達均明顯降低（均P＜0.05）。結論：阿托伐他汀可降低LDLR-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中的血脂水平，可有效抑制IL-17a、LP-PLA2的表達，對抗動脈粥樣硬化的作用。

動脈粥樣硬化；阿托伐他??；白介素-17a；脂蛋白相關磷脂酶A2

動脈粥樣硬化性心臟病是全球范圍內最常見和危害最大的疾病之一，在大多數國家里已成為主要死亡原因，在中國，其發病率以及病死率也呈逐年上升的趨勢。上世紀90年代Ross等人提出了動脈粥樣硬化的慢性炎癥學說，炎癥參與了動脈粥樣硬化的各個過程，包括斑塊的起始、形成、硬化發展及斑塊從穩定到不穩定的改變[1]。白介素-17a （interleukin-17a，IL-17a）主要由Th17細胞分泌， 可通過誘導巨噬細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細 胞活化，進而釋放大量細胞因子（如基質金屬蛋白酶等），從而導致板塊形成及破裂[2]。脂蛋白相關磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，LP-PLA2）是心血管疾病中的一種新的炎癥因子，可以通過水解氧化低密度脂蛋白產生溶血磷脂酰膽堿（Lyso-PC）和氧化型游離脂肪酸（ox-FA），促進動脈粥樣硬化的形成和發展[3]。本實驗采用低密度脂蛋白受體基因敲除（low density lipoprotein receptor knock out，LDLR-/-）小鼠，以高脂飲食建立動脈粥樣硬化模型，通過觀察阿托伐他汀治療后斑塊內IL-17a以及LP-PLA2改變，進而評價阿托伐他汀對動脈粥樣硬化的治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級8周齡雄性LDLR-/-小鼠22只，購自南京大學模式動物研究所[動物生產許可證號SCXK（蘇）2005-0002] ，飼養于浙江中醫藥大學動物中心SPF級動物房；阿托伐他?。⑵胀祝┯擅绹x瑞公司提供；實時定量引物、Trizol試劑、DEPC水（RNase-free and DNase-free）購自美國Invitrogen 公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；PCR試劑盒（SYBRGreen Realtime PCR Master Mix）、96孔板及封板膜購自ABI公司；小鼠LP-PLA2抗體購自武漢三鷹公司，小鼠IL-17a多克隆抗體、β-actin購自美國Abcam公司；PMSF、RIPA、山羊抗兔抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇海門碧云天試劑公司；ECL化學發光顯色試劑盒、PVDF膜購自美國Millipore公司；DAB顯色液購自北京中杉金橋；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 模型的建立與分組 8周齡雄性LDLR-/-小鼠18只，隨機分為2組：正常飲食組和高脂飲食組。其中，正常飲食組6只，給予普通飲食；高脂飲食組12只給予高脂飼料（脂肪21%，膽固醇0.15%）。喂養8周后，將12只高脂飲食組小鼠隨機分成高脂對照組和治療組，每組6只。治療組繼續給予高脂飲食并以阿托伐他汀60 mg·kg-1·d-10.9%氯化鈉溶液稀釋后灌胃；高脂對照組繼續給予高脂飲食并以等容量0.9%氯化鈉溶液灌胃。剩下的6只正常飲食組小鼠繼續給予普通飲食并以等容量0.9%氯化鈉溶液灌胃作為普食對照組。

1.3 標本制備和取材 喂養8周后，小鼠禁食禁水8 h。腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（0.1 mL/20 g體質量）麻醉，摘眼球取血，分離血清。乙醇消毒皮膚后剖開胸腔，暴露心臟，剪下右心耳，將注射器插入心尖，用高壓消毒后預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）20 mL灌流。灌流完畢后分離出整根小鼠主動脈，取主動脈根部于4%多聚甲醛中浸泡24 h，常規石蠟包埋、固定。每只小鼠從主動脈根部連續做4 μm厚度切片，每隔5張取一張用于蘇木素-伊紅染色（HE）及免疫組織化學染色。其余主動脈分2份于-80 ℃保存。

1.4 血脂測定 通過全自動生化分析儀測血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）的表達水平。

1.5 免疫組織化學 取石蠟切片62 ℃烤箱烘烤1 h，常規脫蠟后枸櫞酸高壓修復3 min，PBS清洗 5 min×3次，0.3%過氧化氫（H2O2）溶液阻斷30 min， 5%山羊血清室溫封閉30 min，IL-17a抗體（1:500）4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次，二抗室溫孵育1 h，DAB染色，蘇木素核染，水洗，封片。結果判定采用Image Pro Plus 6.0軟件進行分析，計算出平均吸光度值（mean absorbance，MA）=累積吸光度值/斑塊面積。

1.6 實時熒光定量PCR測LP-PLA2、IL-17a mRNA的表達 通過Trizol提取小鼠主動脈總RNA，用Rever-tAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit反轉錄試 劑盒合成cDNA。以上述cDNA為模板，應用ABI 7900HT Prism實時熒光定量PCR儀進行定量PCR檢測。GAPDH引物序列F：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，R：5’-GG GGTCGTTGATGGCAACA-3’，IL-17a引物序列F：5’-TTTA ACTCCCTTGGCGCAAAA-3’，R：5’-CTTTCCCTCCGCATTGAC AC-3’，LP-PLA2引物序列F：5’-GATCGTACCCCGTCGGT TG-3’，R：5’-GTCGAGGCGACCTTGATCTT-3’；PCR條件：預變性95 ℃ 5 min，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）共40個循環。采用GAPDH為內參，進行歸一化各組生物學重復3次。數據分析利用美國Biosystems公司的Sequence Detec-tionsystem（SDS）2.4軟件進行。樣本目的基因的相對表達率（relativeexpression， RQ）采用△△CT方法計算，RQ＝2-△△CT（CT表示PCR 擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環數），△CTsample=CTsample-CT/GAPDHsample，△CTcontrol=CTcontrol-CT/GAPDHcontrol，△△CT=△CTsample-△CTcontrol。

1.7 Western blot法測血管中LP-PLA2蛋白的表達

用RIPA裂解液提取主動脈總蛋白，加入SDS-PAGE上樣緩沖液（4:1），煮沸變性10 min。每孔上樣量為 40μg，用10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，半干轉恒壓15 V轉膜30 min至PVDF膜，TBST洗膜10 min× 3次，5%脫脂奶粉（TBST稀釋）室溫封閉1.5 h，TBST洗膜10 min×3次，敷一抗[LP-PLA2抗體（1:300），β-actin（1:1 000）] ，4 ℃過夜，洗膜10 min×3次，加羊抗兔二抗（1:5 000）室溫孵育1.5 h，TBST洗 膜10 min×3，最后加入ECL底物溶液顯色，使用DNR MicroChemi化學發光儀曝光，以β-actin作為內參，標化LP-PLA2蛋白表達，各組生物學重復3次，技術重復3次，以Quantity One軟件進行半定量分析。

1.8 統計學處理方法 采用SPSS 17.0軟件完成統計學分析。計量資料以±s表示，實驗數據經過方差齊性檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，獨立的兩組間比較用t檢驗，方差不齊時使用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 全自動生化儀檢測血脂結果 高脂對照組小鼠血清TC、LDL含量均高于普食對照組（均P＜0.05），TG含量兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。治療組小鼠在用阿托伐他汀治療8周后，與高脂對照組小鼠相比，血清TC、LDL含量降低（均P＜0.05），TG含量兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1，圖1。

表1 各組小鼠血脂水平的比較（n=6，±s，mmol/L）

表1 各組小鼠血脂水平的比較（n=6，±s，mmol/L）

與普食對照組比：aP＜0.05；與高脂對照組比：bP＜0.05

圖1 各組小鼠血脂水平的變化

2.2 各組小鼠主動根部切片HE染色結果 HE染色可見普食對照組血管內膜完整，未見粥樣斑塊生成，未見泡沫細胞、炎癥細胞聚集；高脂對照組血管內可見粥樣斑塊生成，內膜破損，內膜下大量泡沫細胞、炎癥細胞聚集，管腔狹窄；治療組血管內亦可見粥樣斑塊生成，但與高脂對照組比較，管腔狹窄明顯減輕，內膜下泡沫細胞、炎癥細胞也明顯少于高脂對照組。見圖2。

2.3 各組小鼠主動脈根部切片IL-17a免疫組織化學染色結果 免疫組織化學結果可見，普食對照組動脈管腔內沒有斑塊組織，因而沒有IL-17a的陽性表達，高脂對照組主動脈斑塊中可見明顯的IL-17a陽性表達：MA為0.3468±0.0090；治療組主動脈斑塊中亦可見IL-17a陽性表達：MA為0.1435±0.0108，但是與高脂對照組相比，IL-17a的陽性表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 qRT-PCR法檢測主動脈中LP-PLA2、IL-17a mRNA的表達情況 與空白對照組（1.00±0.00）相比，高脂對照組主動脈LP-PLA2 mRNA的表達（4.35± 0.51），以及IL-17a mRNA的表達（2.30±0.29）明顯升高（P＜0.05）；治療組動脈LP-PLA2 mRNA的表達（1.21±0.11），以及IL-17a mRNA的表達（1.81± 0.24）與高脂對照組相比，則明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

圖2 各組小鼠主動脈根部切片HE染色（×100）

圖3 各組小鼠主動脈根部切片IL-17a表達（×100）

圖4 qRT-PCR檢測主動脈LP-PLA2、IL-17a mRNA的表達

2.5 Western blot法檢測主動脈中LP-PLA2蛋白表達水平 與空白對照組（1.00±0.00）相比，高脂對照組主動脈LP-PLA2蛋白的表達（1.79±0.34）明顯升高（P＜0.05）；治療組主動脈LP-PLA2蛋白的表達（1.16±0.15），與高脂對照組相比，則明顯降低（P

圖5 Western blot法測主動脈中LP-PLA2蛋白的表達

3 討論

他汀類藥物能夠抑制血管內皮的炎癥反應，穩定粥樣斑塊，改善血管內皮功能，延緩動脈粥樣硬化程度，被視為治療冠狀動脈粥樣硬化的一線藥物。近幾年的研究表明，他汀類藥物不但具有降低血脂的作用，還能夠增加斑塊的穩定性，從而預防由斑塊破裂引起的急性冠脈綜合征。本研究采用LDLR-/-小鼠建立動脈粥樣硬化模型，觀察阿托伐他汀對于動脈粥樣硬化模型小鼠血脂水平、動脈粥樣硬化程度以及LP-PLA2和IL-17a表達的影響，阿托伐他汀治療動脈粥樣硬化的機制。結果顯示高脂飲食組小鼠TC、LDL均高于普食對照組，而治療組小鼠TC、LDL水平均低于高脂飲食組。另外，HE染色結果提示阿托伐他汀治療后的小鼠斑塊面積、泡沫細胞以及炎癥細胞的數量均明顯小于高脂對照組?？梢姲⑼蟹ニ〔粌H可以有效降低血脂水平，也有利于抑制斑塊的形成和發展。

Th17細胞是一種新的CD4+T細胞亞型，主要分泌IL-17a因子。近年來，多項研究表明IL-17a在動脈粥樣硬化的發生發展中扮演了重要角色[4-5]。研究表明，IL-17a可以促進血管平滑肌細胞分泌基質金屬蛋白酶和組織因子，上調黏附分子ICAM-1、VCAM-1 和趨化因子的表達從而促進動脈粥樣硬化的發展以及斑塊的破裂[6]。余盼攀等[7]在研究大鼠肝星狀細胞時發現，IL-17可促進基質金屬蛋白酶-9的表達，促進正常的基底膜的降解?；|金屬蛋白酶-9可以加速纖維帽中細胞外基質的降解，使纖維帽變得薄弱而易于破裂。本研究中，高脂飲食喂養后，小鼠動脈斑塊內IL-17a的表達相對于普通飲食組顯著增強，而在應用阿托伐他汀治療后，小鼠動脈斑塊內IL-17a的表達水平明顯少于高脂對照組。說明在動脈粥樣硬化小鼠模型中IL-17a的表達是上調的，這與之前眾多研究相符合。在應用阿托伐他汀治療后，IL-17a的表達明顯下調，進一步證實阿托伐他汀可以通過降低體內IL-17a的表達來達到治療冠狀動脈粥樣硬化的作用。

LP-PLA2是磷脂酶A2家族成員，主要由巨噬細胞、單核細胞、T淋巴細胞和肥大細胞分泌產生。人循環中的LP-PLA2主要和脂蛋白顆粒結合，其中2/3 與LDL結合，其余1/3與VLDL和HDL結合[8]。LP-PLA2能夠水解氧化低密度脂蛋白（oxLDL），將其水解生成卵磷脂以及氧化游離脂肪酸等促炎遞質，后兩者可促進細胞黏附因子、表皮生長因子和血小板源性生長因子的表達，引起內皮功能障礙，促進單核細胞向內膜聚集衍生成巨噬細胞，從而促進動脈粥樣硬化的發生和發展。大量研究表明，LP-PLA2為血管炎癥反應特異性標志物，可以反映粥樣斑塊的嚴重程度，而且在急性冠脈綜合征患者中，LP-PLA2的水平也顯著升高。最新的研究表明，血清LP-PLA2的水平也和支架植入后再狹窄呈正相關[9]。Dohi等[10]通過大量實驗證明：在急性冠脈綜合征患者中，降低循環中LP-PLA2的水平有利于冠脈斑塊的消退。本實驗中，通過高脂飲食喂養后，小鼠動脈中LPPLA2的水平相較普食對照組增強，在阿托伐他汀治療后，LP-PLA2的水平明顯降低。這與之前的研究相符合，進一步說明LP-PLA2對與促進動脈粥樣硬化的形成和發展存在密切關系；阿托伐他汀可通過下調組織內LP-PLA2的表達來延緩動脈粥樣硬化的進展。

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（本文編輯：吳健敏）

Impacts of atorvastatin on expression of IL-17a,LP-PLA2 in low-density lipoprotein receptor knockout mice

NI Yunjie1,LIN Zhenhao1,HOU Lianglei1,WU Yihao1,SONG Lijuan1,HU Huanhuan1,HUANG Xiaoyan2, YANG Deye1,2.
1.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Department of Cardiology,the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University,Hangzhou,310015

Objective:To investigate the effect of atorvastatin on expression of IL-17a,LP-PLA2 in LDLR-knockout (LDLR-/-) mice.Methods:Eighteen 8-week-old male LDLR-/-mice were raised in six cages.Twelve mice were fed with high fat diet for establishing atherosclerosis model.The other six mice were fed with normal diet which was used as the normal diet control group.After eight weeks,mice fed with high fat diet were divided into high fat diet control group (n=6) and atorvastatin group (n=6,60 mg·kg-1·d-1per gavage).The other six mice fed with normal diet which was used as normal diet control group and continued to feed normal diet.All mice were sacrificed after eight weeks.Automatic Biochemical Analyzer was performed to measure serum lipid levels.Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to observe the morphology of plaque.qRT-PCR was performed to analyze the level of expression of IL-17a mRNA and LP-PLA2 mRNA.Immunohistochemistry was performed to analyze the expression of protein IL-17a.Western blot was performed to analyze the expression of protein LP-PLA2.Results:Serum cholesterol (TC) and low density lipoprotein (LDL) levels were significantly higher in high fat diet control group than that in normal diet control group (both P＜0.05),while there were no significantly difference of triglyceride (TG) level between two groups (P＞0.05).TC and LDL levels of Atorvastatingroup compared with the high fat control group were significantly reduced (P＜0.05).Also,there were no significantly difference of TG level between two groups (P＞0.05).Obviously,Atherosclerosis lesion area was observed in high fat diet control group,while there was no atherosclerosis lesion observed in normal diet control group.The expression of IL-17a (both protein and mRNA) and LP-PLA2 (both protein and mRNA) in high fat diet control group was significantly up-regulated than that in the normal diet control group (all P＜0.05).Compared with the high fat control group,atherosclerosis lesion area of the atorvastatin group was significantly decreased,and the expression of IL-17a (both protein and mRNA) and LP-PLA2 (both protein and mRNA) was significantly lower (all P＜0.05).Conclusion:Atorvastatin can contribute to anti-atherosclerosis by inhibiting the expression of IL-17a and LP-PLA2,reducing inflammation in LDLR-/-mice fed with high fat diet.

atherosclerosis; atorvastatin; IL-17a; LP-PLA2

R541

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.003

2014-12-18

國家自然科學基金資助項目（81270230）。

倪云杰（1988-），男，浙江杭州人，碩士生。

楊德業，教授，博士生導師，Email：deyeyang@126.com。