川崎病血清特異相關miR-23a對人臍靜脈內皮細胞生長及遷移的影響

褚茂平，胡晨，周愛華，王慧穎，潘璐璐，仇慧仙，吳蓉洲，趙仙先

（1.第二軍醫大學附屬長海醫院 心血管內科，上海 200433；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 兒童中心，浙江 溫州 325015；3.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童心臟中心，溫州醫科大學 心血 管發育與轉化醫學研究所，浙江 溫州 325027）

·論 著·

川崎病血清特異相關miR-23a對人臍靜脈內皮細胞生長及遷移的影響

褚茂平1，胡晨2，周愛華2，王慧穎2，潘璐璐3，仇慧仙3，吳蓉洲3，趙仙先1

（1.第二軍醫大學附屬長海醫院 心血管內科，上海 200433；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 兒童中心，浙江 溫州 325015；3.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童心臟中心，溫州醫科大學 心血 管發育與轉化醫學研究所，浙江 溫州 325027）

目的：探討川崎病（KD）血清特異相關miR-23a對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）生長及遷移的影響。方法：采用Real-time PCR驗證前期篩選獲得的川崎病急性期血清特異性表達的miR-23a，生物信息學分析結合炎癥細胞因子及受體芯片檢測來篩選靶基因；共分4組，miR-23a mimic組、mimic NC組、miR-23a inhibitor組、inhibitor NC組，通過miR-23a模擬物（mimic）及抑制物（inhibitor）的轉染調節HUVECs內miR-23a的表達，用CCK-8法檢測細胞增殖的變化，用劃痕試驗和Transwell小室法檢測其對細胞遷移的影響。結果：Real-time PCR發現miR-23a在KD急性期患兒血清中表達水平明顯高于KD恢復期、正常對照組及發熱對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與mimic NC組對比，上調miR-23a表達可促進HUVECs增殖、遷移，差異有統計學意義（P＜0.05）；與inhibitor NC組對比，下調miR-23a表達可抑制HUVECs的增殖、遷移，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：miR-23a在急性期KD患兒血清中表達上調，干預HUVECs內miR-23a表達可影響其增殖和遷移，提示miR-23a異常表達可能參與KD的發生發展。

川崎病；microRNA-23a；人臍靜脈內皮細胞；增殖

川崎病（kawasaki disease，KD）又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，主要發生在5歲以下嬰幼兒，是以全身血管炎為主要表現的急性發熱出疹性疾病。自日本學者川崎富作于1967年首次報道[1]以來，世界各國均有報道，但以亞裔發病率最高。目前，在我國KD已經取代了風濕熱成為后天性心臟病的主要發病原因之一，其中冠狀動脈損害（coronary artery lesions，CAL）是KD最嚴重的并發癥，其發病率和耐藥率逐年上升[2]，但至今KD的病因和發病機制尚不明確。MicroRNA（miRNA）為長度約22 nt的內源性短鏈RNA，通過與編碼蛋白質mRNA互補結合，沉默其表達，參與調控細胞的增殖、遷移、凋亡等一系列過程[3]。miR-23位于染色體19p13.13，于多種腫瘤組織中表達均上調，且有報道稱其與心肌肥厚、肌肉萎縮有關[4]，見表1。其靶基因主要有ETNK1、FUT9、RAB39B、TOP1等，這些靶基因主要與信號轉導、DNA復制、物質代謝及核苷酸代謝有關；也有研究表明miR-23a與促炎細胞因子的表達有正相關性。

本研究首先驗證了經過Exiqon miRCURY LNA 芯片篩選出KD血清中特異表達的miR-23a在不同疾病中的差異表達情況，通過體外培養人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）合成miR-23a mimic/inhibitor轉染血管內皮細胞并觀察其對細胞增殖、遷移功能的影響，旨在進一步闡明KD血清中特異表達的miR-23a對內皮細胞功能的影響。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2013年3月至2013年12月在溫州醫科大學附屬育英兒童醫院確診的20例KD急性期患兒（KD組）血清，其中男12例，女8例，年齡＜1歲6例，1～3歲10例，＞3歲4例。入選標準：參照第7版《諸福棠實用兒科學》KD診斷標準。正常對照血標本采集自同時期同醫院的健康體檢者20例（正常對照組），選擇未發現器質性疾病且血液相關實驗室檢查無異常及年齡、性別與KD患兒相匹配的兒童，其中男12例，女8例，年齡＜1歲6例，1～3歲10例，＞3歲4例。發熱對照血標本采集自同時期同醫院急性上呼吸道感染的發熱患兒20例（發熱對照組），未發現器質性疾病且血液相關實驗室檢查無異常，且年齡、性別與KD患兒均相匹配。血常規檢查KD組急性期患兒WBC、CRP和ECR都升高，見表2。

表1 miR-23a簡介

表2 KD急性期患兒和對照組血常規比較（n=20，±s）

表2 KD急性期患兒和對照組血常規比較（n=20，±s）

與發熱對照組、正常對照組比：aP＜0.05

1.2 材料 細胞株：HUVEC株購自ATCC公司，miR-23a mimics、NC mimics、miR-23a inhibitor，inhibitor NC（上海吉瑪制藥技術有限公司）；Lipofectamine 2000 Reagent、Troizol LS Reagent （invirtrogen公司）；1640培養基、0.25% EDTA、PBS（GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK-8（日本同仁化學公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；6孔板、12孔板、24孔板、96孔板（美國Costar公司）；miRNA反轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑（上海楚天生物有限公司）；其他引物均由上海楚天生物有限公司合成，引物序列見表3。

表3 本研究中所用到的引物序列

1.3 方法

1.3.1 分組方法：共分為4組：miR-23a mimic組（轉染miR-23a模擬物，濃度為40 nmol/L）、mimic NC對照組（轉染NC陰性對照模擬物，濃度為40 nmol/L）、 miR-23a inhibitor組（轉染miR-23a抑制物，濃度為40 nmol/L）及inhibitor NC組（轉染NC抑制物，濃度為40 nmol/L）。

1.3.2 RNA的提取：將采集的全血標本2 mL置于真空EDTA抗凝管，2 000 r/min， 離心10 min，取上層血清，按Trizol LS試劑說明書抽提樣品總RNA，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解RNA，取RNA溶 液1μL于Nano 2000上檢測RNA的濃度和純度，以OD 260/OD 280比值在1.8～2.2為合格標準，保存于-80 ℃超低溫冰箱或立即用于后續實驗。

1.3.3 miR-23a表達的驗證：采用反轉錄試劑盒將1 μg總RNA反轉錄為cDNA。20 μL反應體系：包括4μL 5 X reaction buffer，2μL Enzymemix，14 μL稀釋后的總RNA模板。反應條件：42 ℃，60 min， 95 ℃，5 min。以cel-miR-39為外參，采用Real-time PCR進行驗證，混合cDNA模板，nucleasefreewater 和SYBRTMGreenmastermix PCR，反應條件為：95 ℃ 預變性10 min（95 ℃變性10 min、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min）×40個循環，溶解曲線：95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，冷卻40 ℃ 30 s。采用Biorad CFX96實時熒光定量PCR儀器進行，所有樣品3個復孔，記錄Ct值（即每個反應管中熒光信號到達所設定閾值時所經歷的循環數），采用2-△△CT分析各組間相對表達差異。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力：按CCK-8試劑說明書檢測細胞增殖能力，將對數生長期的HUVECs接種于96孔板，采用Lipofectamine 2000轉染至細胞內，分別處理12、24、48、72 h后，每孔不同的時間點加入10μL的CCK-8試劑，避光保存置于培養箱2 h后用酶標儀檢測OD值（450 nm），實驗重復3次。根據下列公式計算：抑制率（%）=（1-實驗組OD值/陰性對照OD值）×100%。

1.3.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力：用記號筆在6孔板背后畫線，將對數生長期的HUVECs接種于6孔板，垂直于背后的橫線劃痕，用PBS洗滌細胞去除劃下的細胞，加至無血清培養基，采用Lipofectamine 2 000轉染至細胞內，按24、48、72 h取 樣，倒置顯微鏡下拍照，實驗重復3次。

1.3.6 Transwell小室法檢測細胞遷移能力：將對數生長期的HUVECs接種于24孔板，采用Lipofectamine 2 000轉染至細胞內，取0.3 mL細胞懸液，加入Transwell小室上室中，下室加入含有50 ng/mL FBS的培養基0.6 mL，置入培養箱中繼續培養24 h。 取出Transwell吸去上室細胞，拭去上層底膜上面的細胞，于3%甲醛中固定30 min，0.1%結晶紫染色15 min。顯微鏡選取4個視野，觀察遷移至下層的細胞并進行拍照，計數每個視野的平均細胞量。遷移抑制率（%）=（對照組遷移細胞平均數-轉染組遷移細胞平均數）/對照組遷移細胞平均數×100%

1.4 統計學處理方法 采用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析。計量資料用±s表示；計數資料用頻率（%）表示；計量資料中2組連續性數據間比較采用獨立樣本t檢驗；多樣本平均數間比較采用單因素方差分析方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-23a在KD患兒血清中的表達 RT-qPCR產物溶解曲線均單峰，特異性擴增相應的miRNA，見圖1。與KD恢復期組、發熱對照組、正常對照組相比，KD急性期組血清中miR-23a的表達量明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖1 qPCR驗證miR-23a的表達

圖2 miR-23a的差異表達

2.2 miR-23a對HUVECs增殖功能的影響 miR-23a mimic和miR-23a inhibitor及mimic NC及inhibitor NC組轉染HUVECs 24、48和72 h后，miR-23a mimic可 以促進HUVECs的增殖，與陰性對照（mimic NC）比差 異有統計學意義（P＜0.05）；miR-23a inhibitor可以抑制HUVECs的增殖，與inhibitor NC（Inhibitor NC）比差異有統計學意義（P＜0.05），與miR-23a inhibitor組比，miR-23a mimic組可以促進細胞的增殖（P＜0.05），見表4。

2.3 miR-23a對HUVECs遷移功能的影響 細胞劃痕實驗和Transwell小室法檢測結果顯示，miR-23a mimic可以促進HUVECs的遷移，而miR-23a inhibitor 可以減弱HUVECs的遷移，差異有統計學意義（P＜ 0.05），與miR-23a inhibitor組比，miR-23a mimic組可以促進細胞的遷移，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3-5。

表4 miR-23a干預對HUVECs增殖的影響（±s）

表4 miR-23a干預對HUVECs增殖的影響（±s）

與mimic NC組比：aP＜0.05；與inhibitor NC組比：bP＜0.05

圖3 miR-23a對HUVECs遷移的影響（劃痕實驗，結晶紫染色，×200）

圖4 miR-23a對HUVECs遷移的影響（Transwell小室法，結晶紫染色，×100）

圖5 miR-23a對HUVECs遷移的影響（Transwell小室法）

3 討論

KD是一種以全身血管炎為主要病變的急性發熱、出疹性疾病[2]，多個國家的醫學工作者對KD進行了大量的研究，但其病因、機制依然尚不明確。如未對KD作出及時的診斷和治療，可導致患兒出現缺血性心臟病、心肌梗死及猝死。其主要病理改變為全身非特異性血管炎，病程早期為全身微血管炎，約2周后表現為主動脈分支的動脈內膜炎和動脈周圍炎，尤其是冠狀動脈多易受累，部分病例在急性期形成動脈瘤。這種血管炎的改變是心血管系統病例損傷的重要基礎。組織學研究表明，KD患者冠狀動脈血管壁三層均遭到破壞且增生顯著，內皮細胞裸露，大量炎癥細胞浸潤，電鏡下可見血管內皮細胞間隙增大、穿孔，血管呈透明變化，這些變化的主要機制是內皮細胞的功能紊亂[10]。目前認為所有的發病機制最后可能歸結于冠狀動脈及其他中等肌性血管的內皮損害及彈力纖維損傷，導致血管炎的發生，血管壁的破壞，最終發生冠狀動脈瘤及其他動脈瘤。血管內皮細胞在循環血液和血管平滑肌細胞之間起著機械屏障作用，也是人體最大且功能活躍的內分泌器官，由于機械屏障作用，它很容易受到機體內外各種理化因素的損傷，同時作為內分泌器官，使受損后的血管內皮細胞內分泌功能失調，導致正常的平衡被打破，從而導致心血管系統的功能障礙。目前對于KD發生發展過程中血管內皮損傷有關的分子事件做了許多研究，Terai等[11]首次利用免疫組織化學的方法在1例死于冠狀動脈血栓的患兒心臟標本中發現冠狀動脈血管內皮細胞表達了HLA-DR抗原，提示KD急性期冠狀動脈內皮細胞激活或受累，徐明國等[12]發現KD患兒循環內皮細胞損傷，陳樹寶等[13]提出，在KD中存在血管衰竭現象，包括內皮細胞、平滑肌細胞功能的紊亂及結構的改變，這提示KD患兒存在血管內皮細胞的功能紊亂。

外周血廣泛地參與了機體的免疫功能和炎癥反應，KD急性期血清能真實、全面地反映KD患兒整體的血管炎癥及免疫的功能，而miRNA不編碼蛋白質，通過與靶基因mRNA特異性相互作用降解或抑制靶基因的翻譯而發揮調控作用，可與靶mRNA3’UTR結合發生相互作用，抑制其翻譯或誘導其降解，從而調節靶基因[14]。近年來已確定miRNA在各個生理過程中發揮了重大作用，如在生物發育，脂肪代謝，細胞分化、增殖和凋亡等過程中發揮重要作用[15]，Zhang等[16]和Cordes等[17]都認為miRNAs在血管生成和病變及心血管疾病中發揮重要作用。Shimizu 等[5]首次報道miRNA與KD的相關性之后，2014年Yun 等[6]認為KD患兒血清中miR-200c和miR-371-3p表達是升高的，Rowley等[7]研究了KD患兒冠狀動脈中表達的miRNA，Ni等[8]指出急性期miR-155/SOCS1信號通路的激活和miR-31的過表達可能導致了Tregs下降，從而參與KD的發生發展進程，提示循環中的miRNAs可以影響細胞內的mRNA，參與內皮細胞的調節，從而參與KD的發生發展。我們采用Exiqon miRCURY LNA芯片篩選出KD急性期血清中特異性表達miR-23a。miR-23a屬于miR-23a/27a/24基因簇，該 基因簇擁有獨立的啟動子，能夠表達3種成熟miRNA： miR-23a、miR-27a、miR-24。該基因簇在許多疾病中表達異常，能夠調控細胞的周期、增殖、分化，血細胞生成和心臟肥大等生命過程[9]。對死于冠脈瘤的KD患兒進行病理檢查發現，從外膜、血管周圍組織逐漸至官腔，呈現成纖維細胞的增殖及不同程度的炎癥。

在HUVECs的基礎上，研究miR-23a對血管內皮細胞基本生物學功能及分泌功能的影響，并初步探究其機制，分別包括用CCK-8法檢測細胞增殖功能、細胞劃痕試驗和Transwell實驗檢測細胞遷移功能等，我們發現miR-23a可以促進細胞增殖、細胞遷移。Hashimoto等[18]研究發現，與正常血清組和感染發熱組血清相比，KD血清可以促進HUVECs的細胞增殖，認為KD血清促進HUVECs細胞增殖的作用和血清中的某些成分相關，這與miR-23a mimic促進內皮細胞的增殖相一致。本實驗采用細胞劃痕試驗和Transwell實驗檢測轉染miR-23a mimic后內皮細胞的遷移能力，發現miR-23a具有促進內皮細胞遷移的作用，推測miR-23a可通過調節細胞因子從而發揮促進細胞遷移和游走的作用。miRNA通過與靶基因mRNA特異性相互作用降解或抑制靶基因的翻譯而發揮調控作用。因此，尚需進一步進行miRNA靶基因的識別和功能研究。

本研究從miRNA的角度出發研究了KD血清中特異相關miR-23a，發現其可以影響內皮細胞的基本生物學功能，造成內皮細胞功能的紊亂，并影響血管內皮細胞分泌功能，從而參與KD發生發展的過程。如果能對miR-23a的作用機制有更進一步的了解，將能更好地闡釋KD的發病機制，對其早期診斷及防治提供更好的方向。

[1] Kawasaki T.Acute febrile mucocutaneous syndrome with lymphoid involvement with specific desquamation of the fingers and toes in children[J] .Arerugi,1967,16(3): 178-222.

[2] Li XH,Li XJ,Li H,et al.Epidemiological survey of Kawa-saki disease in Sichuan province of China[J] .J Trop Pediatr,2008,54(2): 133-136.

[3] Murchison EP,Hannon GJ.miRNAs on the move: miRNA biogenesis and the RNAi machinery[J] .Curr Opin Cell Biol,2004,16(3): 223-229.

[4] Maragkakis M,Alexiou P,Papadopoulos GL,et al.AccuratemicroRNA target prediction correlates with protein repres-sion levels[J] .BMC Bioinformatics,2009,10: 295.

[5] Shimizu C,Kim J,Stepanowsky P,et al.Differential expres-sion of miR-145 in children with Kawasaki disease[J] .PLoS One,2013,8(3): e58159.

[6] Yun KW,Lee JY,Yun SW,et al.Elevated serum level of mi-croRNA (miRNA)-200c and miRNA-371-5p in children with Kawasaki disease[J] .Pediatr Cardiol,2014,35(5): 745-752.

[7] Rowley AH,Pink AJ,Reindel R,et al.A study of cardiovas-cular miRNA biomarkers for Kawasaki disease[J] .Pediatr Infect Dis J,2014,33(12): 1296-1299.

[8] Ni FF,Li CR,Li Q,et al.Regulatory T cell microRNA ex-pression changes in children with acute Kawasaki disease[J] .Clin Exp Immunol,2014,178(2): 384-393.

[9] 劉敏,鄭德先.miR-23a,miR-24-2和miR-27a在炎癥反應中的表達及其在LPS誘導的巨噬細胞活化中的調節機制研究[D] .北京: 北京協和醫院,2013.

[10] Inoue Y,Kimura H,Kato M,et al.Sera from patients with Kawasaki disease induce intercellular adhesion molecule-1 but not Fas in human endothelial cells[J] .Int Arch Allergy Immunol,2001,125(3): 250-255.

[11] Terai M,Kohno Y,Namba M,et al.Class II major histocom-patibility antigen expression on coronary arterial endothe-lium in a patient with Kawasaki disease[J] .Hum Pathol,1990,21(2): 231-234.

[12] 徐明國,門麗娜,王海霞,等.川崎病患兒循環內皮祖細胞功能與血漿超敏C反應蛋白濃度的關系[J] .中國當代兒科雜志,2010,12(7): 513-517.

[13] 陳樹寶,張耀輝.小兒超聲心動圖圖譜[M] .南京: 江蘇科學技術出版社,2004.

[14] Murchison EP,Hannon GJ.miRNAs on the move: miRNA biogenesis and the RNAi machinery[J] .Curr Opin Cell Biol,2004,16(3): 223-229.

[15] Maragkakis M,Alexiou P,Papadopoulos GL,et al.Accurate microRNA target prediction correlates with protein repres-sion levels[J] .BMC Bioinformatics,2009,10: 295.

[16] Zhang XB,Chen BS.Perspective of microRNA in cardio-vascular-associated diseases[J] .Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi,2008,36(7): 661-663.

[17] Cordes KR,Srivastava D.MicroRNA regulation of cardio-vascular development[J] .Circ Res 2009,104(6): 724-732.

[18] Hashimoto Y,Yoshinoya S,Aikawa T,et al.Enhanced endo-thelial cell proliferation in acute Kawasaki disease (muco-cutaneous lymph node syndrome)[J] .Pediatr Res,1986,20(10): 943-946.

（本文編輯：吳彬）

MicroRNA-23a regulate the growth and migration of HUVECs in Kawasaki disease

CHU Maoping1,HU Chen2,ZHOU Aihua2,WANG Huiying2,PAN Lulu3,QIU Huixian3,WU Rongzhou3,ZHAO Xianxian1.
1.Department of Cardiology,the Affiliated Changhai Hospital of Second Military University,Shanghai,200433; 2.Department of Children’s Center,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 3.Children’s Heart Center,the Second Affiliated Hospital & Yuying Children’s Hospital,Institute of Cardiovascular Development & Translational Medicine,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To study the effect of miR-23a that on the growth and migration of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in Kawasaki disease.Methods: Real-time PCR was used to confirme miR-23a that differential expression between Kawasaki disease and controls.Bioinformatics analysis and the gene chip of inflammatory cytokine were used to target the genes.Transfect the miR-23a mimic/inhibitor in HUVECs.CCK-8 assay was used to measure the effect of proliferation.Cell scratch method and transwell chamber were performed to investigate the effect of migration.Results:MiR-23a was significantly higher in Kawasaki disease.The miR-23a mimic could promote the proliferation and migrate of HUVECs,the mi-23a inhibitor could inhibit the proliferation and migrate (P＜0.05).Conclusion:The miR-23a play an important role in the development and progression of KD and could effect the proliferation and migrate of HUVECs.

kawasaki disease; microRNA-23a; human umbilical vein endothelial cells; proliferation

R725.4

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.002

2015-02-23

浙江省自然科學基金資助項目（LY12H02003）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2012ZDA035）。

褚茂平（1969-），男，浙江溫州人，主任醫師，博士。

趙仙先，主任醫師，教授，Email：13601713431@163.com。