三個攜帶線粒體DNA tRNAGln4363T＞C突變的中國漢族原發性高血壓家系臨床及遺傳特征分析

于涵，耿軍偉，林枝，薛凌，唐霄雯，鄭斌嬌，呂建新，盧中秋，管敏鑫，3

（1.溫州醫科大學 Attardi線粒體生物醫學研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 急診科，浙江 溫州 325015；3.浙江大學 遺傳研究所，浙江 杭州 310058）

·論 著·

三個攜帶線粒體DNA tRNAGln4363T＞C突變的中國漢族原發性高血壓家系臨床及遺傳特征分析

于涵1，耿軍偉1，林枝1，薛凌1，唐霄雯1，鄭斌嬌1，呂建新1，盧中秋2，管敏鑫1，3

（1.溫州醫科大學 Attardi線粒體生物醫學研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 急診科，浙江 溫州 325015；3.浙江大學 遺傳研究所，浙江 杭州 310058）

目的：通過對3個攜帶tRNAGln4363T＞C突變的原發性高血壓家系進行臨床、遺傳和分子特征分析評估，探討線粒體tRNAGln4363T＞C突變在母系遺傳原發性高血壓發生發展中的作用。方法：PCR擴增848例原發性高血壓患者和254例正常對照樣本線粒體tRNA基因，對攜帶tRNAGln4363T＞C突變的3個家系進行家系及線粒體基因相關分析。結果：共發現3例患者攜帶tRNAGln4363T＞C突變，突變率為0.35%，患者家系中共有母系成員28位，其中12位患有不同程度的高血壓，發病年齡從27到64歲，平均發病年齡為44歲，有1位非母系成員患病，母系成員中男性患者的后代均未表現出發病。3位先證者的線粒體基因全序列分析結果顯示，除同質性tRNAGln4363T＞C突變外，還有64個多態性位點，分別屬于東亞線粒體單體型Z3、Z3和B4d。tRNAGln4363T位點在進化上高度保守，該位點對應tRNAGln二級結構反密碼子環的A38位，tRNAGln4363T＞C突變可能影響此位點與反密碼子識別功能的高保真性和正常tRNA結構的形成及結構的穩定性。結論：3個攜帶tRNAGln4363T＞C突變的中國漢族原發性高血壓家系母系遺傳特征明顯，線粒體tRNAGln4363T ＞C突變可能是這3個原發性高血壓家系發病的主要分子基礎。3個攜帶線粒體tRNAGln4363T＞C突變的原發性高血壓家系表現出的同質性突變、發病年齡及外顯率不同等表型差異特征提示核修飾基因、環境因素和線粒體遺傳背景等可能對tRNAGln4363T＞C突變家系原發性高血壓的表型表達有一定的影響。

原發性高血壓；線粒體DNA；tRNAGln；基因突變；漢族

原發性高血壓（essential hypertension，EH）是一種原因不明、以動脈血壓升高為主要臨床表現的復雜性疾病，是嚴重的公共健康問題，高血壓中90%～95%為EH[1]。EH是一種由多因素引發的復雜性疾病，其發病機制尚未完全明確。EH的發病被普遍認為是遺傳與環境因素共同作用的結果[2]，近年來發現，越來越多的EH家系存在母系遺傳特征，提示線粒體基因與核基因共同參與了EH的發生發展[3-5]。 線粒體tRNA基因突變是與疾病相關的突變熱點區域，已報道的與EH相關的線粒體tRNA突變有tRNAMet4435A＞G[6-7]、tRNAMet/tRNAGln4401A＞G[8]、tRNAGln4353T＞C[9]、tRNAThr15927G＞A[10]突變等[11]，所涉及的位點在進化上大多高度保守，這些突變可能改變了線粒體tRNA的結構和功能，從而影響蛋白質合成，造成氧化磷酸化缺陷，降低ATP的合成，增加活性氧的產生[12]，而腦、心等高能量代謝臟器對ATP的依賴程度很高，如果線粒體功能缺陷，將會影響這些臟器功能，可能誘發EH等多種疾病[13-15]。 因此，本研究對848例EH患者進行線粒體tRNA基因的突變篩查，分析后發現了35個變異位點，通過計算254例正常對照者的等位基因頻率、預測二級結構和種系發生分析對這些變異位點進行初步評估，發現tRNAGln4363T＞C突變可能是與疾病相關的致病突變；進一步研究發現有3例無親緣關系的EH患者攜帶此突變。為了進一步分析tRNAGln4363T ＞C突變對EH的影響，本研究對家系先證者和家系成員進行了臨床資料調查和分子遺傳學分析，探討tRNAGln4363T＞C突變在EH中的作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 848例EH患者中692例來自溫州醫科大學附屬第一醫院急診科、心內科的住院和門診患者，156例來自體檢中心的患者；同時收集同一地區血壓正常，無高血壓家族史的正常對照254例，均來自溫州醫科大學附屬第一醫院體檢中心。本研究對EH患者中的3個家系進行研究，先證者及其家系成員均居住在溫州地區。按照溫州醫科大學倫理委員會管理規定的方法得到受訪者的知情同意并簽署知情同意書。對家系成員的一般情況和血壓進行測量和調查，采血進行常規和生化檢測。

1.2 臨床檢查 對家系成員進行一般情況調查、體格檢查和心血管疾病危險因子等實驗室指標檢 查[16]。一般情況調查包括對性別、年齡、民族、身高、體質量及環境因素包括吸煙、飲酒、飲食等進行詳細詢問，以及有無高血壓病史、發病年齡、是否用藥治療、患者的用藥時間、用藥劑量、是否伴隨其他癥狀等情況調查。血壓測量采用間接測量法，第一和第五柯氏音分別指示收縮壓和舒張壓，測量血壓前靜坐5 min，安靜狀態下測量3次取平均值，對于血壓≥140/90 mmHg或者服用降壓藥的患者診斷為高血壓[17]。采用心電圖評估心臟功能，對家系成員在知情同意后采血進行生化檢查，包括血糖、血脂、肝、腎功能以及電解質等。

1.3 線粒體基因組突變分析

1.3.1 全基因組DNA提取：抽取家系成員外周靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，采用DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 4.0，Takara）進行全基因組DNA提取，-20 ℃保存備用。

1.3.2 線粒體全序擴增：以提取的DNA為模板，采用24對重疊引物特異性PCR擴增線粒體全序[18]，產物純化后測序，所得結果用Codoncode Aliger軟件與人類線粒體DNA標準劍橋序列（Genbank，NC_ 012920）進行比對，分析其中突變位點，同時，對家系其他成員和254例正常對照進行線粒體tRNAGln基因PCR擴增，測序并分析，方法同上。

1.3.3 種系發生學分析：采用人、鼠、牛、爪蟾4個物種線粒體DNA全序列進行初步分析，17個靈長類物種進行進一步分析。將線粒體DNA全序進行種間比對分析，保守性指數（conservation index，CI）通過將人的核苷酸變異與其他16種靈長類物種的該位點進行比對計算得出，即相應位點核苷酸為野生型的物種個數占17個物種數的百分比，如果該值不小于75%說明該位點在進化上是保守的。

1.3.4 東亞單體型分析：根據東亞線粒體單體型樹對先證者線粒體全基因組的測序結果進行單體型分型，以探討在相同單體型的情況下是否存在EH表型的差異[19]。

2 結果

2.1 臨床及遺傳學評估 WHP12家系來自溫州市平陽縣，先證者（I I-1），69歲男性患者，高血壓病史5年，血壓175/76 mmHg，長期服藥；無吸煙史，30年飲酒史；血常規及生化檢測結果正常；心電圖示左心室高電壓，T波改變。其弟I I-3，65歲，血壓150/90 mmHg；其他家系成員血壓正常，也無其他疾病，詳見表1-2。此家系共有母系成員6位，1位死亡，2位患高血壓，平均發病年齡為64歲，此家系母系成員高血壓發病率為33.3%，非母系成員的發病率為0%。WHP13家系來自溫州市平陽縣，先證者（I I-2），45歲女性患者。高血壓病史5年，血壓為160/90 mmHg；無吸煙飲酒史；血常規及生化檢查結果均正常；心電圖正常。其1弟、1妹及3個兒子均患有高血壓，無其他疾病，詳見表1-2。此家系共有母系成員11位，1位死亡，7位患有高血壓，平均發病年齡為33.5歲，此家系母系成員高血壓發病率為63.6%，非母系成員的發病率為16.7%。

WHP14家系來自溫州市永嘉縣，先證者（I I-2），45歲女性患者。高血壓病史2年，血壓值為140/110 mmHg；無吸煙飲酒史；血常規及生化檢查結果均正常；心電圖正常。其母親（I-2），72歲，患有高血壓30余年，血壓值150/85 mmHg，有糖尿病史，血糖偏高，其他檢查均正常；另有一妹患有高血壓；其余家系成員無高血壓病史，詳見表1-2。此家系共有母系成員10位，3位患有高血壓，平均發病年齡42歲，母系成員高血壓發病率為30%，非母系成員的發病率為0%。

2.2 線粒體基因分析 為進一步分析線粒體背景 對EH外顯率和表現度的影響，本研究對WHP12、WHP13 和WHP14 3個家系先證者進行了線粒體全基因組的 擴增和測序，并將測序結果和修正的人類線粒體DNA 標準劍橋序列（Genbank，NC_012920）比對[20]，發現3個無親緣關系的先證者同時攜帶tRNAGln4363T ＞C突變，且該位點在17個靈長類物種中保守性為76.5%[21]。這3個mtDNA序列都存在許多變異位點（見表3）：D-Loop區的19個已報道的多態性位點，無功能意義；12S rRNA基因區3個，16S rRNA基因區3個， 以及tRNAThr15930G＞A和tRNAPhe596T＞C突變，均為報道過的多態性位點；在13個多肽編碼區存在37個突變位點，包括同義突變25個，錯義突變12個（http://www.mitomap.org or http://www.genpat.uu.se/mtDB）。這些錯義突變分別為：ND1基因3394T＞C（30Y＞H），ND2基因5263C＞T（265A＞V），ATP6基因8584G＞A（20A＞T）、8701A＞G（59T＞A）、8860A＞G（112T＞A），ND3基因10398A＞G（114T＞A），ND5基因12361A＞G（9T＞A）、12362C＞T（9T＞A）和13942A＞G（536T＞A），Cytb基因14766C＞T（7I ＞T）、15308A＞G（98I＞V）、15326A＞G（194T＞A）。將上述位點進行17個靈長類物種保守性分析，發現除ND1基因3394位點外，其余位點均不保守。將以上位點進行單體型分析，WHP12、WHP13、WHP14家系分別屬于東亞線粒體單體型Z3、Z3和B4d[19]。

表1 3個家系先證者臨床資料匯總

表2 3個家系成員臨床資料匯總

WHP13家系先證者I I-2攜帶的同質性ND1 3394T ＞C突變在17個物種進化上高度保守，使ND1第30位氨基酸由酪氨酸變為組氨酸，有報道顯示其與多種疾病相關[22]。家系分析發現WHP13家系母系成員EH發病率遠高于另外2個家系，且臨床特征較另外2個家系有所不同，因此ND1 3394T＞C突變可能與tRNAGln4363T＞C突變共同作用影響該家系EH表型的表達。

線粒體tRNAGln為重鏈編碼tRNA，4363T相對應于tRNAGln二級結構反密碼子環的A38位置，其在17種靈長類及鼠[23]、牛[24]和爪蟾等20個物種中是高度保守的。Wong等[25]在發育遲緩、胃腸反流、視網 膜炎發育不良和感音神經性耳聾女性兒童患者中發現了此突變，并證實4363T＞C是一個同質性突變。本研究在3個EH家系中都發現了此突變，提示tRNAGln4363T＞C突變可能與EH相關。目前報道的發生在線粒體tRNA二級結構38位上的致病性突變包括tRNAAsn5692A＞G[26]、tRNASer（UCN）7480A＞G[27]和tRNAThr15923A＞G[28]突變等。tRNA 38位置是反密碼子環鄰近反密碼子莖的最后一個堿基。二級結構預測中上述致病性突變通過與相對應的32位形成W-C堿基配對，延長反密碼子莖縮小反密碼子環，破壞tRNA合成酶識別和密碼子的配對，造成tRNA功能障礙，降低線粒體蛋白合成率引起線粒體功能障礙，引起疾病產生。tRNAGln4363T＞C突變可能對反密碼子識別的高保真性產生影響，從而參與疾病的發生。

圖1 3個攜帶tRNAGln4363T＞C突變家系圖（黑色填充表示EH患者，箭頭所指為先證者）

圖2 tRNAGln4363T＞C突變鑒定

表3 3個先證者線粒體基因全序分析表

續表3

續表3

3 討論

通過家系調查發現，這些患者的生活環境和生活方式不同，沒有血緣關系，卻有EH這一唯一共同的臨床特征。EH發病年齡和病情嚴重程度在各家系 及家系成員間存在差別，母系成員的發病年齡從27 到64歲不等，平均發病年齡為44歲。3個家系的EH發 病具有以下特征：①外顯率：WHP12、WHP13和WHP14 家系母系成員的外顯率分別為33.3%、63.6%和30%。WHP13家系外顯率明顯高于WHP12和WHP14。②發病年齡：WHP12家系第I I I代無母系成員，第I I代母系成員的平均發病年齡為64歲。WHP13家系中第I I、第I I I代母系成員的平均發病年齡為40和27歲，平均發病年齡為33.5歲，第I I I代發病年齡明顯提前，低于平均發病年齡。WHP14家系中第I、I I代發病年齡分別為40和44歲，第I I I代均未發病。③血壓情況：3個家系的平均血壓值分別為162.5/83 mmHg、152.5/84 mmHg和145/97.5 mmHg，血壓嚴重情況在3個家系間差異不明顯。

EH在這3個家系中呈母系遺傳，且分子遺傳學分析發現他們擁有一個共同的分子基礎即mtDNA tRNAGln4363T＞C突變。此突變在254例正常對照者中出現的頻率為0，在17個靈長類物種中的保守性指數為76.5%，而且位于tRNAGln高度保守的位置上，表明線粒體tRNAGln4363T＞C突變可能是這3個母系遺傳EH家系發病的主要分子基礎。與其他與高血壓相關的mtDNA突變一樣，tRNAGln4363T＞C也是同質性突變，該突變位于tRNAGln二級結構反密碼子環的A38位置，可能影響線粒體tRNA的結構和功能，

導致輕度的線粒體功能缺陷，進而引發疾病的產生。WHP13家系母系成員EH發病率遠高于另外2個家系，且臨床特征較另外2個家系有所不同，推測線粒體ND1 3394T＞C突變可能與tRNAGln4363T＞C突變共同作用影響該家系EH表型的表達。而3個攜帶線粒體tRNAGln4363T＞C突變的EH家系表現出的同質性突變、發病年齡及外顯率不同等表型差異特征提示核修飾基因、環境因素和線粒體遺傳背景等可能對tRNAGln4363T＞C突變家系EH的表型表達有一定的影響[29] 。

[1] Gu D,Reynolds K,Wu X,et al.Prevalence,awareness,treatment,and control of hypertension in china[J] .Hyperten-sion,2002,40(6): 920-927.

[2] Lifton RP,Gharavi AG,Geller DS.Molecular mechanisms of human hypertension[J] .Cell,2001,104(4): 545-556.

[3] Wallace DC.Mitochondrial diseases in man and mouse[J] .Science,1999,283(5407): 1482-1488.

[4] Schon EA,Bonilla E,DiMauro S.Mitochondrial DNA mu-tations and pathogenesis[J] .J Bioenerg Biomembr,1997,29 (2): 131-149.

[5] Watson B Jr,Khan MA,Desmond RA,et al.Mitochondrial DNA mutations in black Americans with hypertension-asso-ciated end-stage renal disease[J] .Am J Kidney Dis,2001,38(3): 529-536.

[6] Lu Z,Chen H,Meng Y,et al.The tRNAMet4435A＞G muta-tion in the mitochondrial haplogroup G2a1 is responsible for maternally inherited hypertension in a Chinese pedigree[J] .Eur J Hum Genet,2011,19(11): 1181-1186.

[7] Liu Y,Li R,Li Z,et al.Mitochondrial transfer RNAMet4435A＞G mutation is associated with maternally inherited hypertension in a Chinese pedigree[J] .Hypertension,2009,53(6): 1083-1090.

[8] Li R,Liu Y,Li Z,et al.Failures in mitochondrial tRNAMetand tRNAGlnmetabolism caused by the novel 4401A＞G mutation are involved in essential hypertension in a Han Chinese Family[J] .Hypertension,2009,54(2): 329-337.

[9] Qiu QM,Li RH,Jiang PP,et al.Mitochondrial tRNA muta-tions are associated with maternally inherited hyperten-sion in two Han Chinese pedigrees[J] .Human Mutation,2012,33(8): 1285-1293.

[10] Jia Z,Wang X,Qin Y,et al.Coronary heart disease is asso-ciated with a mutation in mitochondrial tRNA[J] .Hum Mol Genet,2013,22(20): 4064-4073.

[11] 薛凌,陳紅,孟燕子.高血壓相關的線粒體DNA突變[J] .遺傳,2011,33(9): 911-918.

[12] Gong S,Peng Y,Jiang P,et al.A deafness-associated tRNA-His mutation alters the mitochondrial function,ROS pro-duction and membrane potential[J] .Nucleic Acids Res,2014,42(12): 8039-8048.

[13] Postnov Iu V,Orlov SN,Budnikov E,et al.[Mitochondrial energy conversion disturbance with decrease in ATP produc-tion as a source of systemic arterial hypertension] [J] .Kardi-ologiia,2008,48(8): 49-59.

[14] Dromparis P,Michelakis ED.Mitochondria in vascular health and disease[J] .Annu Rev Physiol,2013,75: 95-126.

[15] Sutendra G,Dromparis P,Kinnaird A,et al.Mitochondrial activation by inhibition of PDKII suppresses HIF1a signaling and angiogenesis in cancer[J] .Oncogene,2013,32(13): 1638-1650.

[16] Moser M.World Health Organization-International Society of hypertension guidelines for the management of hyperten-sion-do these differ from the U.S.recommendations? Which guidelines should the practicing physician follow?[J] .J Clin Hypertens (Greenwich),1999,1(1): 48-54.

[17] Canzanello VJ,Sheps SG.The sixth report of the Joint Na-tional Committee on prevention,detection,evaluation,and treatment of high blood pressure: What’s New? What’s Dif-ferent?[J] .Cardiol Rev,1998,6(5): 272-277.

[18] Rieder MJ,Taylor SL,Tobe VO,et al.Automating the iden-tification of DNA variations using quality-based fluorescence re-sequencing: analysis of the human mitochondrial genome [J] .Nucleic Acids Res,1998,26(4): 967-973.

[19] Tanaka M,Cabrera VM,Gonzalez AM,et al.Mitochondrial genome variation in eastern Asia and the peopling of Japan [J] .Genome Res,2004,14(10A): 1832-1850.

[20] Andrews RM,Kubacka I,Chinnery PF,et al.Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mi-tochondrial DNA[J] .Nat Genet,1999,23(2):147.

[21] Brandon MC,Lott MT,Nguyen KC,et al.MITOMAP: a hu-man mitochondrial genome database——2004 update[J] .Nucleic Acids Res,2005,33(Database issue): D611-613.

[22] Zhang M,Zhou X,Li C,et al.Mitochondrial haplogroup M9a specific variant ND1 T3394C may have a modifying role in the phenotypic expression of the LHON-associated ND4 G11778A mutation[J] .Mol Genet Metab,2010,101(2-3): 192-199.

[23] Bibb MJ,Van Etten RA,Wright CT,et al.Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA[J] .Cell, 1981,26(2 Pt 2): 167-180.

[24] Gadaleta G,Pepe G,De Candia G,et al.The complete nu-cleotide sequence of the Rattus norvegicus mitochondrial genome: cryptic signals revealed by comparative analysis between vertebrates[J] .J Mol Evol,1989,28(6): 497-516.

[25] Wong LJ,Liang MH,Kwon H,et al.Comprehensive scan-ning of the entire mitochondrial genome for mutations[J] .Clin Chem,2002,48(11): 1901-1912.

[26] Munscher C,Muller-Hocker J,Kadenbach B.Human aging is associated with various point mutations in tRNA genes of mitochondrial DNA[J] .Biol Chem Hoppe Seyler,1993,374 (12): 1099-1104.

[27] Seibel P,Lauber J,Klopstock T,et al.Chronic progressive external ophthalmoplegia is associated with a novel mutation in the mitochondrial tRNA(Asn) gene[J] .Biochem Biophys Res Commun,1994,204(2): 482-489.

[28] Yoon KL,Aprille JR,Ernst SG.Mitochondrial tRNA (thr) mutation in fatal infantile respiratory enzyme deficiency[J] .Biochem Biophys Res Commun,1991,176(3): 1112-1115.

[29] Vasan RS,Beiser A,Seshadri S,et al.Residual lifetime risk for developing hypertension in middle-aged women and men: the framingham heart study[J] .JAMA,2002,287(8): 1003-1010.

（本文編輯：吳健敏）

The genetic analysis of mitochondrial tRNAGln4363 T ＞ C mutation associated with essential hypertension in three Chinese Han pedigrees

YU Han1,GENG Junwei1,LIN Zhi1,XUE Ling1,TANG Xiaowen1,ZHENG Binjiao1,LV Jianxin1,LU Zhongqiu1,GUAN Minxin1,3.
1.Attardi Institute of Mitochondrial Biomedicine,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 2.Department of Emergency,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 3.Institute of Genetics,Zhejiang University,Hangzhou,310058

Objective:To analyze and evaluate the clinical,genetic and molecular characteristics of mtDNA in three Han Chinese pedigrees with essential hypertension and explore the role of tRNAGln4363T＞C mutation in the development of those maternally inherited essential hypertension.Method:Mitochondrial tRNA gene of 848 Chinese Han essential hypertension subjects and 254 control subjects were amplified with PCR.Members of 3 Chinese Han pedigrees with mitochondrial tRNAGln4363T＞C mutation underwent mitochondrial DNA genetic analysis and pedigree assessment.Result:Three essential hypertension subjects were found with tRNAGln4363T＞C mutation,and with variable severity and age-of-onset in hypertension among the three pedigrees.The percentage of this mutation was 0.35%.Twelve of 28 matrilineal relatives in these families exhibited the variable degree of hypertension at the age at onset of 27 to 64 years old and at the average of 44 years old,while none of the offspring at affected father had hypertension.Sequence analysis of complete mitochondrial genomes in 3 pedigrees showed that,in addition to the homoplasmic 4363T＞C mutation,there were also 64 other mutations,and the mtDNA polymorphisms belonged to haplogroups Z3,Z3 and B4d,respectively.The tRNAGln4363T was localized at immediately 3’end to the anticodon,corresponding to highly conserved adenine at position 38 of tRNAGln,the4363C＞T mutation might affect the high fidelity of recognition and the formation and stability of normal tRNA structure.Conclusion:The occurrence of the tRNAGln4363T＞C mutation in three genetically unrelated pedigrees affected by hypertension and the absence in 254 Chinese controls strongly indicate that this mutation is associated with essential hypertension.The homoplasmic form,late onset and incomplete penetrance of hypertension observed in those Chinese pedigrees suggest that tRNAGln4363T＞C mutation may be insufficient to produce a clinical phenotype,nuclear modifier gene (s) or environmental factor (s) may play a role in the phenotypic expression of essential hypertension related to tRNAGln4363T＞C mutation.

essential hypertension; mitochondrial DNA; tRNAGln; gene mutations; Han pedigress

R544.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.001

2014-11-26

國家青年科學基金資助項目（31401070，31100903）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2110399）；浙江省衛生廳醫藥衛生科學研究基金資助項目（Y2009A135）；溫州醫學院科研發展基金資助項目（QTJ13017）。

于涵（1992-），女，黑龍江綏化人，碩士生。

管敏鑫，教授，博士生導師，Email：gminxin88@zju.edu.cn。