內(nèi)窺鏡法豬克隆胚胎移植研究

竇紅偉，鄭 華，田家寧，夏代剛，蒙小云，李 勇，石 偉

（1. 深圳市農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司，廣東 深圳 518023；2. 深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518083）

內(nèi)窺鏡法豬克隆胚胎移植研究

竇紅偉2，鄭 華1*，田家寧2，夏代剛1，蒙小云1，李 勇2，石 偉1

（1. 深圳市農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司，廣東 深圳 518023；2. 深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518083）

傳統(tǒng)的手術(shù)法開展豬克隆胚胎移植會(huì)使受體母豬的創(chuàng)傷比較大，術(shù)后恢復(fù)慢和容易傷口感染等會(huì)影響克隆胚胎著床，從而影響移植成功率；同時(shí)，受體利用率低。為摸索新的豬克隆胚胎移植方法，和提高受體在胚胎移植中的利用次數(shù)，降低受體手術(shù)應(yīng)激，應(yīng)用內(nèi)窺鏡開展了20頭豬克隆胚胎移植試驗(yàn)，結(jié)果分娩1頭（4頭活仔），移植成功率僅為5%。研究表明，內(nèi)窺鏡法開展豬克隆胚胎移植是可行的，但還需要繼續(xù)摸索總結(jié)，才能提升移植成功率，熟練和標(biāo)準(zhǔn)化操作是內(nèi)窺鏡移植能否成功的關(guān)鍵。

克隆；豬胚胎移植；內(nèi)窺鏡

目前豬克隆胚胎移植的主流方法是手術(shù)法[1]。傳統(tǒng)的手術(shù)法開展豬克隆胚胎移植會(huì)使受體母豬的創(chuàng)傷比較大，術(shù)后恢復(fù)慢，容易傷口感染，從而影響克隆胚胎著床和移植成功率。借鑒克隆羊技術(shù)[2]，內(nèi)窺鏡法進(jìn)行豬克隆的胚胎移植是值得嘗試的。內(nèi)窺鏡法屬于微創(chuàng)手術(shù)，切口很小，只需在腹部切開1 cm左右的2～3個(gè)小口，將腹腔鏡插入腹腔，在腹腔鏡引導(dǎo)下，將胚胎植入子宮。這種方法雖然仍需要麻醉和類似于常規(guī)手術(shù)的程序，但由于手術(shù)切口小，切口恢復(fù)快，術(shù)后反應(yīng)輕，出血腫脹時(shí)間可大大減少，不但降低了手術(shù)的感染概率，對(duì)受體母豬損傷和應(yīng)激亦小得多，故可增加手術(shù)的精確性及安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

腹腔內(nèi)窺鏡、顯示器、氣腹機(jī)、冷光源、CO2氣體、受體母豬、培育好的克隆胚胎數(shù)枚、無(wú)菌操作實(shí)驗(yàn)室、手術(shù)臺(tái)、手術(shù)麻醉劑、氧氣、笑氣及呼吸麻醉機(jī)系統(tǒng)一套、手術(shù)刀、縫合針線等。要求試驗(yàn)?zāi)肛i單獨(dú)飼養(yǎng)，術(shù)前徹底清潔消毒；移植的胚胎要求發(fā)育良好，嚴(yán)格按照恒溫38.5 ℃條件保存；手術(shù)前對(duì)手術(shù)室進(jìn)行24 h紫外線照射處理；對(duì)參與手術(shù)的人員手術(shù)前做好消毒凈化工作；手術(shù)所用的刀具、耗材做好消毒無(wú)菌工作，確保胚胎移植過程處于無(wú)菌操作。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供體細(xì)胞建系及選擇

1.2.1.1 供體的選擇

在本試驗(yàn)開始前，根據(jù)我公司種豬群育種數(shù)據(jù)選擇遺傳指數(shù)高的，生產(chǎn)性能好的公豬作為此次試驗(yàn)的供體。

1.2.1.2 組織樣品采集

保定好供體，采樣人員對(duì)供體耳緣周邊進(jìn)行消毒清理，剃掉皮膚上層的絨毛，用采樣器剪取0.5 cm×0.5 cm的耳肉，裝入樣品管，放入專用冷凍箱低溫（4 ℃)保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞建系。

1.2.1.3 細(xì)胞建系

將采好的耳緣組織樣品送至深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司進(jìn)行細(xì)胞建系，并傳代培養(yǎng)和超低溫液氮凍存。

1.2.1.4 克隆胚胎構(gòu)建

將所建細(xì)胞系傳至P5～P6，利用手工克隆技術(shù)進(jìn)行克隆胚胎的構(gòu)建，并且體外培養(yǎng)至第6天，發(fā)育至囊胚。用于移植的胚胎，挑選原則是盡量選取形態(tài)良好、擴(kuò)張充分、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)明顯的囊胚。

1.2.2 胚胎受體的選擇

胚胎受體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：分娩過程長(zhǎng)短正常、異常仔豬少、產(chǎn)后恢復(fù)快、未有子宮炎癥狀及奶水好的母豬，同時(shí)選擇斷奶發(fā)情要在7 d以內(nèi)的母豬，而且發(fā)情表現(xiàn)要很明顯，本試驗(yàn)由于研究經(jīng)費(fèi)的限制和減小對(duì)試驗(yàn)場(chǎng)生產(chǎn)沖擊，對(duì)受體母豬的選擇沒有嚴(yán)格執(zhí)行這些標(biāo)準(zhǔn)，而是選取了一些斷奶較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)情、空懷、返情和后備母豬。

1.2.3 移植時(shí)間

1.2.3.1 受體斷奶時(shí)間

在確定了手術(shù)移植時(shí)間后，反推母豬斷奶時(shí)間，即手術(shù)時(shí)間反推5 d為發(fā)情日期，發(fā)情日期反推6 d為斷奶日期。

1.2.3.2 移植胚胎的胚齡

經(jīng)過手工克隆重構(gòu)胚，為發(fā)育至6 d的囊胚。

1.2.4 手術(shù)前的準(zhǔn)備工作

1.2.4.1 移植胚胎的準(zhǔn)備

用專門的撿胚器對(duì)擬移植的胚胎進(jìn)行分撿并裝入麥管，每頭受體母豬準(zhǔn)備2個(gè)麥管，每個(gè)麥管大約裝入30枚胚胎。將裝好胚胎的麥管放入恒溫的運(yùn)輸箱。

1.2.4.2 受體母豬

發(fā)情后對(duì)受體母豬實(shí)行單欄飼養(yǎng)，術(shù)前做好清洗及消毒工作，手術(shù)前12 h禁食。

1.2.4.3 手術(shù)儀器準(zhǔn)備和檢查

準(zhǔn)備手術(shù)器械、高壓蒸汽鍋、手術(shù)服、外科手術(shù)手套、口罩、縫線、洞巾、磺胺、生理鹽水、碘酊、酒精、酒精棉、紙巾、消毒紗布。對(duì)所有進(jìn)入手術(shù)室的器材都要進(jìn)行滅菌處理。首先確定手術(shù)需要幾套滅菌器材，滅菌前用洗潔精清洗器材并用蒸餾水洗凈，然后通過高壓蒸汽鍋進(jìn)行高壓高溫滅菌；高壓蒸汽鍋在103.4 kPa（1.05 kg/cm2）蒸汽壓下，溫度達(dá)到121.3 ℃，維持15～20 min，即可達(dá)到滅菌的效果；已滅菌的物品做好標(biāo)記，與未滅菌的物品分開保存，以免弄錯(cuò)。

1.2.5 豬克隆胚胎的移植手術(shù)

1.2.5.1 操作準(zhǔn)備與消毒

1）把受體母豬趕到緩沖間，用套嘴鋼絲繩保定，注射誘導(dǎo)麻醉劑復(fù)方獸用氯胺酮2 mL。

2）把受體豬抬到手術(shù)臺(tái)上，用加新潔爾滅的清水清洗腹部，剃毛，擦干。

3）把受體豬套上呼吸面罩，打開氧氣流量計(jì)開關(guān)到0.8 L/min（浮子小球浮動(dòng)到刻度線），接著將異氟烷開到最大5%，最后打開笑氣（N2O）流量計(jì)到0.5 L/min。

4）用75%酒精噴灑手術(shù)器械載臺(tái)，用消毒紙巾擦干。

5）手術(shù)人員戴口罩和帽子，穿手術(shù)服，最后戴手術(shù)手套，注意穿戴規(guī)則和順序，操作時(shí)切忌碰到手套的外面，防止污染。

6）用手術(shù)鑷夾持碘酊消毒手術(shù)部位(由內(nèi)往外，成螺旋狀)，再噴灑75%酒精脫碘，然后用生理鹽水沖洗，酒精和生理鹽水的噴灑方法同碘酊消毒一樣，由內(nèi)往外，不能來回重復(fù)。最后用消毒紗布拭干微創(chuàng)手術(shù)部位及外圍。

1.2.5.2 微創(chuàng)開刀

為了在受體母豬體內(nèi)能夠準(zhǔn)確找到子宮部位，需要開3個(gè)小創(chuàng)口。首先用手術(shù)刀在肚臍附近割一個(gè)2 cm的創(chuàng)口，插入氣腹針，手感穿過肌肉后的鏤空感，馬上停止，連上氣腹機(jī)軟管，慢慢加大腹壓，直到加到最大，觀察受體腹部變化，并叩打腹部，聽聲音并同時(shí)看氣腹機(jī)的讀數(shù)，如果進(jìn)氣的話，讀數(shù)會(huì)不斷增加。當(dāng)讀數(shù)達(dá)到4～5 L的時(shí)候，受體腹部會(huì)有明顯的鼓起。

1.2.5.3 引入內(nèi)窺鏡

把光纖和光源連接起來，把內(nèi)窺鏡連線和成像儀連接起來，當(dāng)受體腹部有明顯鼓起時(shí)，拔下氣腹針，插入穿刺器，同時(shí)把氣腹機(jī)軟管連接穿刺器上，拔出套管內(nèi)的穿刺針，插入連接成像儀和光源的內(nèi)窺鏡，觀察腹腔內(nèi)部情況。把內(nèi)窺鏡鏡頭對(duì)準(zhǔn)腹壁相應(yīng)位置，插入另外2個(gè)穿刺器。

1.2.5.4 尋找輸胚位置

穿刺器插好后，拔出穿刺針，插入2把抓取鉗，內(nèi)窺鏡與抓取鉗配合找到子宮角，并順著子宮角用2把鉗子交替夾持，找出卵巢，觀察卵巢的排卵情況，可以剝開輸卵管傘，觀察后再把卵巢用輸卵管傘包起來。找出宮管接合處，用抓取鉗夾持子宮角，調(diào)整好輸胚角度。

1.2.5.5 輸胚

調(diào)整到最佳位置后，放開另一把抓取鉗，并把16#鈍性打孔針經(jīng)穿刺器套管伸入腹腔，在宮管結(jié)合部打孔，避免在可見血管稠密處進(jìn)針，將裝有胚胎的注射針經(jīng)該孔伸入子宮腔中，徐徐推入豬克隆胚胎。輸胚完成后用止血鉗夾持小孔一段時(shí)間，防止出血，另一側(cè)子宮同上操作。

1.2.5.6 縫合

輸胚結(jié)束后，放空腹腔內(nèi)的氣體，確保放空后拔下穿刺器套管，傷口撒上磺胺后縫合1～2針，手術(shù)即結(jié)束。

1.2.6 術(shù)后管理及觀察

待受體母豬完全清醒后，單獨(dú)飼養(yǎng)管理，視傷口愈合情況決定是否需要相應(yīng)治療。如恢復(fù)良好，按照配種后1個(gè)月母豬標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)管理，在28 d時(shí)通過B超進(jìn)行查孕，確定受體是否懷孕。

2 結(jié)果與分析

表1 內(nèi)窺鏡法豬克隆胚胎移植試驗(yàn)結(jié)果

2013年5月15日至8月26日間，我們共開展了20頭母豬的內(nèi)窺鏡法移植試驗(yàn)。從移植效果來看，18頭受體母豬都返情。L12003504號(hào)母豬雖然沒有返情但剖腹產(chǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)仔，也沒有死胎和木乃伊，應(yīng)該是胚胎死亡后被吸收了。L9033714號(hào)母豬剖腹產(chǎn)4頭活仔。內(nèi)窺鏡法胚胎移植20頭母豬成功1頭，分娩率達(dá)到5%（1頭/20頭），移植效果不甚理想。但既然有了1頭受體母豬分娩，說明內(nèi)窺鏡法開展豬克隆胚胎移植是可行的，只是還需要繼續(xù)摸索總結(jié)，才能提升移植成功率。

3 討論

本研究嘗試內(nèi)窺鏡法進(jìn)行豬克隆胚胎移植，但移植成功率較低，究其原因在于受體母豬的選擇。

3.1 受體母豬的選擇

受體母豬因素對(duì)克隆豬生產(chǎn)效率的影響是顯著的[3]。我們利用腹腔內(nèi)窺鏡開展克隆豬的胚胎移植，只是覺得原理上可行，抱著試試看的心態(tài)，為減少對(duì)豬場(chǎng)正常生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的影響，所以選取的受體母豬基本上都是繁殖異常母豬，其中有4頭為返情母豬，7頭為空懷母豬，1頭為后備母豬，只有8頭是斷奶母豬，且基本是推遲發(fā)情的母豬。由于這些受體母豬本身繁殖異常，即便按正常程序配種，其受胎率和分娩率也可能不高，所以造成克隆成功率低。

3.2 內(nèi)窺鏡操作需要專業(yè)技能，熟練和規(guī)范操作是移植成功的關(guān)鍵

由于整個(gè)試驗(yàn)過程都是在視野狹窄的內(nèi)窺鏡下進(jìn)行，操作難度大，力度、角度和位置沒有掌握好，或者熟練度不高都會(huì)影響試驗(yàn)效果。譬如，內(nèi)窺鏡剛插入腹腔時(shí)，與腹腔溫度有溫差，如果不對(duì)鏡頭進(jìn)行預(yù)熱，會(huì)出現(xiàn)鏡頭結(jié)霧影響操作；插入另外2個(gè)穿刺器時(shí)，如果力量沒有把握好，不注意腹壁情況，會(huì)扎穿腹壁傷到內(nèi)臟；卵巢和子宮角的查找，會(huì)延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間和造成傷害；子宮角打孔會(huì)造成穿孔或刺入子宮壁，造成胚胎損失和移植失敗等等。熟能生巧，只有不斷嘗試和總結(jié)，提高操作技能，并不斷將操作標(biāo)準(zhǔn)化，才能真正地提高胚胎移植成功率。

[1] 李旭陽(yáng)，邳明偉，孫慧敏，等.克隆豬的胚胎移植技術(shù)及其應(yīng)用[J].豬業(yè)科學(xué)，2006， 23（2）：10-12.

[2] 王申元，周歡敏，張立，等.不同處理方法對(duì)綿羊克隆胚胎的移植比較研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（1）：51-52.

[3] 衛(wèi)恒習(xí)，李秋艷，高鳳磊，等. 胚胎移植方法和受體母豬因素對(duì)克隆豬生產(chǎn)效率的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(15)：3147-3153.

2014-11-13）

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)：CARS-36）、深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：JSA200904011807A）