二烯丙基二硫下調β-catenin抑制人胃癌MGC803細胞EMT

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(1.懷化市第一人民醫院，湖南 懷化 418000；2.湖南省胃癌研究中心，湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，南華大學腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001)

·基礎醫學·

二烯丙基二硫下調β-catenin抑制人胃癌MGC803細胞EMT

向姝霖1,2#，劉芳2#，夏紅2，曾希2，蘇波2，董琳2，凌暉2，蘇琦2*

(1.懷化市第一人民醫院，湖南 懷化 418000；2.湖南省胃癌研究中心，湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，南華大學腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001)

目的研究二烯丙基二硫(DADS)抑制人胃癌MGC803細胞EMT與形態學變化。方法應用相差顯微鏡與透射電鏡觀察30 mg·L-1DADS處理后的MGC803細胞形態學與超微結構的變化。RT-PCR與Western blot檢測β-catenin和EMT標記E-cadherin與Vimentin表達。結果30 mg·L-1DADS處理MGC803細胞24 h后，相差顯微鏡顯示，與未處理比較，細胞圓形、橢圓形，核漿比值降低，巢狀分布，均未見偽足。透射電鏡顯示，細胞表面微絨毛數目減少，細胞核變規整，核漿比值下降，異型性降低，細胞與細胞之間出現連接結構，細胞器增多。RT-PCR與Western blot表明，DADS可呈時間依賴性分別下調MGC803細胞β-catenin和Vimentin mRNA與蛋白和上調E-cadherin mRNA與蛋白。結論DADS可通過下調β-catenin上調E-cadherin與下調Vimentin抑制EMT和偽足形成。

二烯丙基二硫； 人胃癌MGC803細胞； EMT； β-catenin； E-cadherin； Vimentin

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。據最新統計，胃癌的發生率與死亡率分別為全球第四位與第二位，每年新發病例約95.16萬，死亡約72.31萬。由于患者就診時大多已經發生侵襲轉移，從而療效差，中位生存期不超過10個月，5年生存率低于10%，嚴重威害人類的生命健康[1,2]。因此，開發有效的抗腫瘤藥物，對治療胃癌具有重要意義。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的脂溶性有效成分，可抑制多種腫瘤細胞增殖，其機制與調節生物酶降低化學致癌物毒性，抑制DNA加合物形成，阻滯腫瘤細胞周期演進，誘導腫瘤細胞分化和調亡，組蛋白修飾，抑制血管形成與侵襲等有關[3]。我們已經證明，DADS可體內外明顯抑制人胃癌細胞增殖，與激活p38，抑制ERK，調節ATR/Chk1/Cdc25C/cyclin B1等相關分子，上調組蛋白乙酰化和p21WAF1表達，阻滯G2/M期，上調miR-200b與 miR-22等有關[4-8]。并且，可通過下調LIMK1、p-Cofilin1、MMP-9和上調TIMP-3抑制人胃癌細胞遷移與侵襲[9-11]。本研究觀察DADS對人胃癌細胞EMT與形態學的影響，探討抑制遷移與侵襲的機制。

1 材料和方法

1.1試劑DADS：Fluka公司產品，純度80%，與Tween80以1∶2比例充分溶解，加入體積分數為0.90的生理鹽水稀釋100倍，作為母液保存于-20 ℃冰箱。小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI-1640培養基(Gibco公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，RT試劑盒(Invitrogen 公司)，PCR試劑(Promega公司)，BCA蛋白定量檢測試劑盒(Pierce公司)，ECL發光檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，β-catenin、E-cadherin，Vimentin與β-actin抗體購自美國Abcam公司。

1.2細胞培養人胃癌MGC803細胞系南華大學腫瘤研究所保存。在含10%小牛血清的RPMI-1640(GIBCO，USA)培養液培養于370C，含5%CO2，恒濕、恒溫培養箱中培養。細胞呈單層生長，鋪滿培養瓶后傳代，傳代時常規吸去培養液，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化3 min，傾去胰酶，加適量含血清培養液吹打成單細胞懸液，按所需濃度接種。

1.3相差顯微鏡檢查30 mg· L-1DADS處理MGC803細胞24 h，倒置相差顯微鏡觀察處理前后細胞形態學變化。

1.4透射電子顯微鏡檢查取對數生長期的MGC803細胞，常規胰酶消化傳代，接種于24孔培養板培養6 h，待細胞貼壁后，處理組加30 mg· L-1DADS，陽性對照用2.0%DMSO(Sigma,USA)，陰性對照為常規培養液，分別處理24 h。消化收集細胞，離心，PBS液洗兩次，2.5%戊二醛/PBS固定24 h，剔取細胞團，PBS清洗3次×10 min；1%鋨酸后固定1 h，PBS清洗3次×10 min；50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水，各10 min；環氧樹脂(Epon 812)浸泡24 h，包埋成塊24 h；LKB-Ⅲ型超薄切片機切成500-700A0超薄切片，硝酸鉛、醋酸鈾雙重染色，H-600日產透射電子顯微鏡下觀察、攝片。

1.3 RT-PCR Total RNA Kit 提取細胞總RNA，在 AMV 酶作用下逆轉錄合成cDNA。設計并合成PCR擴增引物。E-cadherin：F 5′-CTCCCAATACATCTCCCTTCAC-3′,R 5′-CGCCTCCTTCTTCATCATAGTAA-3′,擴增片段423 bp;Vimentin：F 5′-GCGAGG AGAGCAGGATTTC-3′,R 5′-TCTTGTAGGAGTGTCGGTTGTT-3′,擴增片段351 bp;β-catenin:F 5′-GGAAGGGACAGTATCGTTTGTT-3′,R 5′-GCCTCAGCATCTACCA GCATAG-3′,擴增片段334 bp;β-actin：F 5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′,R 5′-AAGGAAGGATGGAAGAGTG-3′,擴增片段564 bp。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，BIO-RAD凝膠成像系統拍照，AlphaImager 2200軟件掃描，計算平均光密度值。

1.4 Western Blot 收集細胞，冰PBS洗兩次，1×107個細胞加入100 μL裂解液(100 mM NaCl，10 mM Tris-Hcl pH 7.6，1 mM EDTA pH 8.0，1 μg·mL-1Aprotinin，100μg·mL-1PMSF)，冰上裂解1 h，12 000 r/min離心10 min，吸出上清液，即細胞總蛋白。Bradford法測定蛋白含量，分光光度計在570 nm波長處測定光吸收值，以溶劑為空白對照，牛血清白蛋白為標準繪制曲線，依據標準曲線推算蛋白含量。使蛋白變性，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCL 20 mmol/L，NaCl 137 mmol/L 含0.1% Tween-20)封閉1h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化學發光劑檢測蛋白質印跡，薄層掃描儀測定光密度值。

1.5統計學處理采用SPSS13.0統計學軟件One-Way Anova或t檢驗進行統計學處理，P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 MGC803細胞形態學改變相差顯微鏡顯示，未處理組MGC803細胞排列松散、彌漫分布，呈長梭形，核大而核漿比值大，胞漿伸出形成纖細偽足，有的細胞具有多個偽足，甚至形成網狀。30 mg· L-1DADS處理24h后，細胞聚集，呈巢狀，細胞圓形、橢圓形，少數細胞呈胖梭形，核漿比值降低，胞漿增多，均未見偽足(圖1)。

圖1 DADS 處理MGC803 的形態學變化(×40) A:非處理組;B: DADS處理組

2.2 MGC803細胞超微結構改變圖2顯示，MGC803細胞形狀不規則，細胞表面有較多或豐富的微絨毛結構，胞漿較少，核大，核漿比值大，細胞核不規則，有切跡，畸形，有大而致密核仁，部分細胞有多個小核仁。細胞漿內，線粒體較少，形狀不規則，線粒體嵴的數量少，常見空泡。粗面內質網不發達，數量少。細胞內多聚核糖體較多而游離核糖體少見。圖3顯示，30 mg· L-1DADS處理24 h后，MGC803細胞表面微絨毛減少，胞漿增多，核漿比值下降，核圓型，較規整，畸形少見，核仁致密或出現核仁內空泡，部分細胞核呈現退行性變；細胞有形成腺腔趨勢，并出現細胞間連接結構；細胞器豐富，線粒體增多，伴有水腫，可見線粒體嵴；除粗面內質網外，有的出現滑面內質網，內質網有擴張、水腫和空泡變性；在胞漿內有成熟的分泌顆粒和脂滴，夾雜單核糖體和多聚核糖體，表明DADS可部分誘導MGC803細胞分化。圖4顯示DMSO處理后細胞的改變與DADS作用相類似。

圖2 非處理組MGC803 細胞超微結構 A：表面有豐富的微絨毛，核漿比值大，核不規則，畸形，有致密核仁(5000×)；B：微絨毛豐富，核大，細胞器稀少(8000×)；C：大而致密核仁，出現空泡，細胞器稀少(10000×)

圖3 DADS處理的MGC803細胞超微結構變化 A：表面微絨毛減少，核形狀較規則，核漿比值變小，細胞器豐富增多(5000×)；B：細胞有形成腺腔趨勢，并且出現細胞間連接結構(8000×)；C：可見線粒體嵴、內質網及核糖體(10000×)

圖4 DMSO處理 MGC803 細胞的超微結構變化 A：表面有豐富的微絨毛，核漿比值大，核不規則，畸形，有致密核仁(5000×)；B：微絨毛豐富，核大，細胞器稀少(8000×)；C：大而致密核仁，出現空泡，細胞器稀少(10000×)

2.3 DADS對E-cadherin表達的影響圖5與6顯示，30 mg· L-1DADS處理MGC803細胞12 h、24 h、48 h后，DADS呈時間依賴性上調MGC803細胞E-cadherin mRNA和蛋白表達 (P<0.05)。

圖5 E-cadherin mRNA表達 M:mark;1:Control;2:12 h;3:24 h;4:48 h. *：P<0.05 vs Control, #：P<0.05 vs 12 h,$：P<0.05 vs 24 h

2.4 DADS對Vimentin表達的影響圖7與8顯示，30 mg· L-1DADS處理MGC803細胞12 h、24 h、48 h后，與對照組相比，DADS可呈時間依賴性下調MGC803細胞Vimentin mRNA和蛋白表達 (P<0.05)。

2.5 DADS對β-catenin表達的影響圖9與10顯示，30 mg· L-1DADS分別處理MGC803細胞12 h、24 h、48 h后，與對照組相比，DADS可呈時間依賴性下調MGC803細胞β-catenin mRNA和蛋白表達 (P<0.05)。

圖6 E-cadherin蛋白表達 1:Control; 2: 12 h; 3: 24 h; 4: 48 h. *:P<0.05 vs Control, #:P<0.05 vs 12 h,$:P<0.05 vs 24 h

圖7 Vimentin mRNA表達 M: mark;1: Control;2: 12 h;3: 24 h;4: 48 h. *：P<0.05 vs Control, #：P<0.05 vs 12 h,$：P<0.05 vs 24 h

圖8 Vimentin蛋白表達 1:Control;2: 12 h;3: 24 h;4: 48 h.*：P<0.05 vs Control,#：P<0.05 vs 12 h,$：P<0.05 vs 24 h

圖9 β-catenin mRNA 表達 M:mark;1:Control;2:12 h;3:24 h;4:48 h. *：P<0.05 vs Control, #：P<0.05 vs 12 h,$：P<0.05 vs 24 h

3 討 論

在腫瘤生長和演進過程中，上皮來源性腫瘤細胞發生上皮-間質轉變(EMT)。EMT在多種因子的調節下，上皮細胞黏附分子E-cadherin下調和間質標記Vimentin上調，導致腫瘤細胞失去原有的緊密連接及粘附力，細胞形態從多邊形變為梭形，從而獲得侵襲與轉移能力[12]。研究證實，Wnt/β-catenin通路與EMT 密切相關。β-catenin直接影響著Wnt通路的開放或關閉，當胞外Wnt增加時，Wnt與Frizzled結合，激活Dsh/Dvl蛋白，進而抑制GSK3Bβ/APC/Axin復合物對β-catenin的磷酸化，保護其不被降解，導致細胞內β-catenin增多，而進入胞核與轉錄因子Tcf/Lef結合，引起c-Myc、Cyclin D1、survivin、c-jun、Fra等靶基因轉錄，促進腫瘤增殖、血管形成、遷移侵襲和轉移[13,14]。因此，β-catenin在促進EMT起著關鍵作用，而靶向抑制β-catenin可逆轉EMT[14]。此外，E-cadherin 缺失是促進EMT的主要因子，E-cadherin/β-catenin 復合物和Wnt/β-caternin通路失調將導致β-catenin 核轉位和EMT與促進靶基因激活[15]。

圖10 β-catenin蛋白表達 1:Control;2:12 h;3:24 h;4:48 h.*:P<0.05 vs Control,#:P<0.05 vs 12 h,$:P<0.05 vs 24 h

Huang 等發現，DADS可明顯通過抑制β-catenin活化下調Bcl-2和上調Bax，下調MMP-9和逆轉EMT[14]。我們先前證明，DADS可體內外通過上調miR-200b與miR-22下調Wnt1、β-catenin和TCF-4 mRNA與蛋白表達，抑制人胃癌細胞增殖與移植瘤生長和誘導凋亡[8]。本研究結果表明，DADS處理后，MGC803細胞從彌漫分布，長梭形，核大而核漿比值大，轉變為巢狀分布，呈圓形、橢圓形，核漿比值降低。超微結構顯示細胞核質比明顯下降，細胞與細胞之間出現連接結構，細胞器數目增多，可見游離核糖體，表明DADS可降低胃癌細胞異型性，細胞形態可從梭形轉變為圓形、橢圓形，具有逆轉EMT作用。RT-PCR與Western blot進一步證明，DADS可呈時間依賴性下調MGC803細胞β-catenin與Vimentin和上調E-cadherin，提示DADS可能通過下調β-catenin上調E-cadherin與下調Vimentin，抑制EMT形成。

近年來，越來越多的研究認為，偽足形成是腫瘤轉移中局部侵襲的重要驅動器，與EMT相關，偽足形成與EMT是惡性腫瘤細胞基本特征。EMT 通過溶解上皮細胞間粘附、調節細胞與基質粘附和誘導分泌ECM 降解蛋白酶導致上皮細胞的遷移與侵襲能力增加。因此，EMT可引發偽足或侵襲性偽足樣結構形成。侵襲性偽足是具有豐富的actin與磷酸酪氨酸和高度降解ECM能力的膜突出，其可聚集MMPs降解ECM，在腫瘤侵襲轉移中起著重要作用。已經鑒定大量蛋白，如EGF、HGF、PDGF與TGFβ等各種生長因子對侵襲性偽足與EMT形成是重要的。這些生長因子可活化非受體Src，而Src 具有誘導侵襲性偽足與EMT 的能力。最近，有人提出腫瘤細胞的偽足形成與actin細胞骨架重組對EMT和轉移相關的新觀點，但是，EMT與偽足形成的直接聯系尚待確定，如果這些關系能夠得到證實，那么將對阻止腫瘤細胞侵襲與轉移的創新性治療方法的研發帶來曙光。因此，進一步研究這些問題是亟待解決的[16-18]。

目前，抑制侵襲性偽足形成與EMT已成為臨床治療的靶點。研究顯示，調控EMT的重要因子Twist通過上調PDGFR表達與活性促進侵襲性偽足形成[17]。A431-Ⅲ 細胞是具有高遷移侵襲能力、MMP-9高表達與EMT增強的鱗癌A431細胞亞型，并且，其侵襲性偽足形成和降解ECM的能力增加。黃酮類化合物的有效成分Luteolin與Quercetin不僅可抑制A431-Ⅲ 細胞EMT，而且可廢除侵襲性偽足形成、降低ECM降解與下調MMP-9，從而減少轉移[18]。miR-21的小分子抑制劑AC1MMYR2與紫杉醇聯合治療可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞和惡性膠質瘤U87VⅢ細胞的遷移侵襲能力，減少高劑量紫杉醇誘導的侵襲性偽足形成，下調β-catenin與vimentin和上調E-cadherin，明顯抑制EMT和減少肺轉移[19]。FHOD1可促進梭形形態與F-actin形成和遷移侵襲，沉默FHOD1可減少EMT腫瘤細胞形成侵襲性偽足與降解ECM的能力[20]。

本研究發現，DADS作用MGC803細胞后，未見偽足形成，超微結構顯示微絨毛減少，表明DADS可抑制人胃癌細胞偽足形成。LIMK1表達或活性增強可導致磷酸化cofilin1水平升高，增加肌動蛋白聚合，促進細胞偽足形成，驅動腫瘤細胞遷移侵襲，而DADS可阻斷Rac1-Pak1/Rock1通路下調LIMK1，抑制cofilin1磷酸化，從而抑制人胃癌細胞遷移與侵襲，提示DADS可能通過下調LIMK1抑制cofilin1磷酸化，降低actin聚合，抑制偽足形成[9-11]。

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DADSInhibitEMTThroughDown-Regulationofβ-catenininHumanGastricCancerMGC803Cells

XIANG Shulin,LIU Fang,XIA Hong,et al

(TheHuaihuaFirsthospital,Huaihua418000Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the effect of EMT and morphology change in human gastric cancer MGC803 cells induced by diallyl disulfide (DADS).MethodsThe phase contrast microscope and transmission electron microscope were employed to confirm the DADS-induced morphology change.The expression of β-catenin,E-cadherin and Vimentin was detected by RT-PCR and Western blot in MGC803 cells after treated by 30 mg·L-1DADS.ResultsThe phase contrast microscope show that MGC803 cells after 24 h treated by 30 mg·L-1DADS were round or ellipse,enlarged cytoplasm,descend nuclear/cytoplasmic ratio,exhibited nest and even not view pseudopodia.Transmission electron microscope results show,that the number of microvilli on cells surface decrease,malignance declining as cellular heteromorphism diminish,nucleocytoplasmic proportion reduce,intercellular conjunctional structure appear and cellular organ increase in cytoplasm after MGC803 cells treated by DADS to contrast untreated.RT-PCR and Western blot indicated that DADS may be down-regulation of β-catenin and Vimentin mRNA and protein up-regulation of E-cadherin mRNA and protein in time dependence in MGC803 cells.ConclusionAll these suggested that DADS may inhibit EMT and pseudopodia via down-regulation of β-catenin to up-regulate E-cadherin and down-regulate Vimentin in MGC803 cells.

diallyl disulfide; human gastric cancer MGC803 cells; EMT; β-catenin; E-cadherin; Vimentin

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.002

2015-07-30；

2015-09-02

國家自然科學基金(81102854,31100935，81374013)；湖南省衛計委科研項目(B2015-182).

*通訊作者，E-mail:suqi1945@163.com.

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(此文編輯：秦旭平)