來自鹿糞便中1株芽孢桿菌的鑒定及抗真菌肽發酵條件研究

翟藝，梁小波

（昆明理工大學食品安全研究院，云南昆明 650500）

來自鹿糞便中1株芽孢桿菌的鑒定及抗真菌肽發酵條件研究

翟藝，梁小波

（昆明理工大學食品安全研究院，云南昆明 650500）

以來自鹿糞便中1株芽孢桿菌為試驗菌株，在分子水平上通過16S rDNA同源性序列分析、比較、鑒定，并通過形態觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、生理生化實驗，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌J-2。分析影響芽孢桿菌J-2產生抗真菌肽的主要因素，通過正交優化實驗得出，芽孢桿菌J-2產生抗真菌肽的最佳發酵條件為500 mL的錐形瓶中加入150 mL初始pH為7.0的PDL（200）培養基，接入9%的液體菌種，在溫度為37℃條件下發酵24 h。

芽孢桿菌；鑒定；抗真菌肽；發酵

長期以來，農業生產中防治病蟲害的方法主要是通過施加或噴灑化學農藥來進行［1］。化學農藥的濫用或不合理使用一方面對農作物產生了高毒、高殘留等諸多問題，嚴重污染了土壤、水體和大氣，甚至破壞了原有的生態平衡［2］；另一方面也不斷增強了一些病菌和害蟲的抗藥性，使農藥的使用量與使用頻度交替上升、惡性循環，農藥在農產品中殘留量不斷增加，極大威脅了人類及牲畜的安全。2012年4月，英國牛津大學、倫敦帝國學院和美國一些大學的科學家在權威科學雜志《Nature》上報道，導致部分動植物物種滅絕的主要原因是傳染病，其中70%是由真菌引起。受人類貿易活動、旅行和氣候變化影響，真菌對人類食物供應和生物多樣性的威脅增大。真菌引起的植物病害現已成為經濟農作物穩產、高產、優產的主要障礙，利用有益微生物防治植物病害是有效途徑之一［3］。由枯草芽孢桿菌研發的殺菌劑具有較好的綜合優勢，在安全性、兼容性等方面而更符合有害生物綜合治理（IPM）要求。2014年，我們從鹿糞便中分離到1株對多種植物病原菌均具有強烈抗性的菌株，通過形態觀察、革蘭氏染色、生理生化試驗等初步確定該菌株為芽孢桿菌，在分子水平上通過16S rDNA同源性序列分析，比較該菌與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌及其它相近菌種的同源性，根據不同菌種之間部分特異性基因序列的差異進行了鑒定，以期為利用其研制環保、節能、高效的生物農藥和相關產品提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試芽孢桿菌由實驗室自行分離篩選。病原指示菌為白色念珠菌，鑒定菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus.subtilis AS 1.1159）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus.amyloliquefaciens AS 1.1131）均購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 培養基

1.2.1 LB液體培養基向450 mL雙蒸水中加入酵母粉2.5 g、胰蛋白胨5.0 g、氯化鈉5.0 g，加熱至溶解，冷卻后經2%氫氧化鈉調節pH為7.0，用雙蒸水補至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 LB固體培養基向450 mL雙蒸水中加入酵母粉2.5 g、胰蛋白胨5.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂5.0 g，加熱至溶解，冷卻后經2%氫氧化鈉調節pH至7.0，用雙蒸水補至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 基礎性培養基向450 mL雙蒸水中加入磷酸氫二鉀0.25 g、硫酸鎂0.10 g、胰蛋白胨5.00 g，待其溶解后，經2%氫氧化鈉調pH至7.0，補水至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.4 PSL培養基（馬鈴薯蔗糖液體培養基）將200 g馬鈴薯去皮，切塊后煮沸30 min，用4層紗布過濾，向濾液中加入蔗糖20 g，自然pH，補水至1 000 mL，115℃高壓滅菌20 min。

1.2.5 PDP培養基（馬鈴薯葡萄糖胰蛋白胨液體培養基）將200 g馬鈴薯去皮，切塊后煮沸30 min，用4層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖20 g、胰蛋白胨5 g，自然pH，補水至1 000 mL，115℃高壓滅菌20 min。

1.2.6 PDL（200）培養基（馬鈴薯葡萄糖液體培養基）將200 g馬鈴薯去皮，切塊后煮沸30 min，用4層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖20 g，自然pH，補水至1000mL，115℃高壓滅菌20min。

1.2.7 PDL（500）培養基（馬鈴薯葡萄糖液體培養基）

將500g馬鈴薯去皮，切塊后煮沸30 min，用4層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖20 g，自然pH，補水至1000mL，115℃高壓滅菌20min。

1.2.8 NB培養基（營養肉湯）向450 mL雙蒸水中加入牛肉膏1.5 g、氯化鈉2.5 g、胰蛋白胨5.0 g，待其溶解后經2%氫氧化鈉調pH至7.0，補水至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 形態觀察與染色利用光學顯微鏡測量菌體直徑、觀察形態；參照相關文獻進行革蘭氏染色、芽孢染色［4］。

1.3.216 S rDNA PCR擴增和序列測定采用Emblye法，對該芽孢桿菌進行16S rDNA擴增反應，根據CTAB法提取芽孢桿菌DNA并將其作為PCR擴增反應的模板［5］。電泳反應30 min，通過凝膠成像系統觀察電泳結果并對PCR產物純化。然后與pUCm-T載體連接，16℃保溫桶內連接過夜。將5 μL連接產物與100 μL感受態細胞在溫度37℃、搖床轉速150 r/min條件下反應1 h，取出后涂布于含1%Amp的LB固體培養基中進行轉化，轉化后提取質粒并委托測序。將所得1444bp序列放入NCBI中進行同源性分析，利用軟件MEGA 5.0構建系統發育樹。

1.3.3 形態比較及特異性基因序列分析在同一培養皿上分別對實驗菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus. subtilis As 1.1159）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus.amyloliquefaciens AS 1.1131）進行劃線培養，在溫度37℃下培養24 h后，觀察形態。根據不同芽孢桿菌基因序列位置不同鑒定。采用CTAB法提取上述3種菌的染色體DNA，并將其作為PCR反應的模板DNA，電泳反應30 min，通過凝膠成像系統觀察電泳結果。

1.3.4 芽孢桿菌J-2發酵上清液的獲得在LB固體培養基中挑取芽孢桿菌J-2單菌落，接種至100 mLLB液體培養基中（250 mL錐形瓶），在溫度37℃、搖床轉速150 r/min下發酵24 h，獲得菌株J-2的發酵液。

1.3.5 碳源種類的影響將碳源1%的葡萄糖、1%的淀粉加入基礎性培養基中，再接種含量7%的芽孢桿菌J-2種子發酵液，在溫度37℃、搖床轉速150 r/min下發酵24 h，并在溫度4℃、轉速13 000 r/min條件下離心1 min，取上清液，經0.22 μm孔徑的無菌水系濾膜過濾，得到芽孢桿菌J-2無菌發酵上清液，以基礎性培養基為對照，采用瓊脂打孔擴散法測量其產生的抑菌圈直徑［7］。

1.3.6 氮源種類的影響將氮源1%的葡萄糖+1%的硫酸銨、1%的可溶性淀粉+1%的硫酸銨、1%的葡萄糖+1%的氯化銨、1%的可溶性淀粉+1%的氯化銨分別替換基礎性培養基中的胰蛋白胨，再接種含量7%的芽孢桿菌J-2種子發酵液，按1.3.5方法得到芽孢桿菌J-2無菌發酵上清液，以碳源培養基為對照，采用瓊脂打孔擴散法測量芽孢桿菌J-2產生的抑菌圈直徑。

1.3.7 培養基種類的影響將芽孢桿菌J-2種子發酵液按接種量7%接種至150 mL含大量碳源的培養基PDL（500）、PDL（200）、PDP、PSL和含大量氮源的培養基LB、NB中（250 mL錐形瓶），按1.3.5方法得J-2無菌發酵上清液，以基礎培養基、碳源培養基、氮源培養基為對照，用瓊脂打孔擴散法測量其產生的抑菌圈直徑。

1.3.8 培養液初始pH的影響將芽孢桿菌J-2接種至100 mLPDL（200）培養基中發酵培養，初始pH分別調至5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，將芽孢桿菌J-2種子發酵液按接種量7%接種至150 mLPDL（200）培養基中（250 mL錐形瓶），按1.3.5方法得到芽孢桿菌J-2無菌發酵上清液，取無菌發酵上清液調pH至7.0，用瓊脂擴散法測量其芽孢桿菌J-2產生的抑菌圈直徑。

1.3.9 發酵溫度的影響將芽孢桿菌J-2接種至100 mL PDL（200）培養基中發酵培養，發酵溫度分別取23、30、37、44、51℃。按1.3.5方法得到芽孢桿菌J-2無菌發酵上清液，測量其產生的抑菌圈直徑。

1.3.10 發酵時間的影響將芽孢桿菌J-2接種至100 mL PDL（200）培養基中發酵培養，將芽孢桿菌種子發酵液按7%接種量接種至150 mL PDL（200）培養基中（250 mL錐形瓶），在溫度37℃、搖床轉速150 r/min條件下分別發酵18、24、30、36、42、48、54 h，按1.3.5方法得到芽孢桿菌J-2無菌發酵上清液，以基礎性培養基為對照，采用瓊脂打孔擴散法測量其產生的抑菌圈直徑。

1.3.11 發酵條件正交優化實驗結合各單因素實驗，選擇PDL（200）、PDL（500）、PSL和PDP為培養基的4個水平，培養基初始pH水平為6.0、7.0、8.0、9.0時，選擇時間為18、24、30、36 h，裝液量定為50、100、150、200 mL（500 mL錐形瓶），接種量水平為3%、5%、7%、9%。對5因素的4個水平分別取值（表1），利用正交表L1645（5因素4水平）實驗，溫度37℃、搖床轉速150 r/min條件下培養芽孢桿菌J-2。收集各發酵條件下的芽孢桿菌J-2無菌發酵上清液，以白色念珠菌為指示菌，用瓊脂打孔擴散法分別測量它們產生的抑菌圈直徑大小，通過方差分析得到芽孢桿菌J-2產生抗真菌肽的較優條件。

表1 正交實驗因素

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌J-2的分類鑒定

2.1.1 個體形態特征及菌落特征如圖1所示，菌株J-2在LB培養基上顯示為不透明白色、表面粗糙、邊緣不規則、不產生色素、短桿狀，兼性厭氧，具有運動性。革蘭氏染色呈陽性，色均勻，可形成內生芽孢，游離芽孢囊橢圓形膨大，表面不易著色。

圖1 菌株J-2染色形態

2.1.216 S rDNA同源性的鑒定菌株J-2染色體DNA用PCR擴增出單一條帶，PCR產物回收純化后，經DNA測序，序列長度為1444 bp。與多種芽孢桿菌同源性的比較數據（表2）表明，菌株J-2與枯草芽孢桿菌的同源性高達99.62%，與解淀粉芽孢桿菌同源性達到99.23%，初步推斷該菌為枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌。通過構建的系統發育樹（圖2）可以看出，菌株J-2與B.subtilis位于同一分支、同一種屬，與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌的同源性均達到99%以上。

表2 J-2與其他相近芽孢桿菌的同源性

圖2 以16S rDNA序列為基礎的J-2菌系統發育樹

2.1.3 與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌形態比較將菌株J-2、枯草芽孢桿菌（B.Subtilis AS 1.1159）和解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens AS 1.1131）在37℃恒溫培養箱內培養20 h，可以看出，菌株J-2生長更旺盛，繁殖速度較快，菌株J-2與枯草芽孢桿菌表面較為粗糙，解淀粉芽孢桿菌表面相對光滑（圖3），菌株J-2的形態與枯草芽孢桿菌更加相近。

圖3 J-2菌與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌形態比較

2.1.4 特異性基因序列的分析從圖4可以看出，枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的部分基因順序明顯不同。在枯草芽孢桿菌中，基因yyaR位于tetB-tetL的下游2003 bp處，而基因yyaO位于tetB（L）的上游并與之相鄰。在解淀粉芽孢桿菌中，yyaR位于tetB-tetL的上游并且與之相鄰。據此設計兩對引物YyaO-F/TetB-R與YyaR-F/TetB-R用于PCR擴增，其中正向引物YyaO-F和YyaR-F分別來自yyaO和yyaR兩個基因的3'末端，反向引物TetB-R來自基因tetB的5'末端。OlegN.Reva等已經成功地利用這兩對引物對多個可能為枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌的菌種進行鑒定［6］。擴增產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠成像系統成像后的結果如圖5所示，當以YyaO-F/TetBR作為引物時，解淀粉芽孢桿菌能夠擴增，而該菌和枯草芽孢桿菌不能擴增，可見該菌與解淀粉芽孢桿菌在這一基因區域內，基因序列可能存在明顯的差異；以YyaR-F/TetB-R作為引物時，解淀粉芽孢桿菌不能被擴增而該菌和枯草芽孢桿菌均能擴增。表明該菌和枯草芽孢桿菌的這一特異性的基因序列相似。綜合分析，確定該菌為枯草芽孢桿菌。

圖4 枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌部分序列的差異

圖5 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 各條件對芽孢桿菌J-2產生抗真菌肽的影響

2.2.1 碳源種類將芽孢桿菌J-2在不同碳源培養基培養，分別記錄12、24 h時芽孢桿菌J-2的生長狀況。從表3可以看出，與對照培養基比較，J-2發酵液較黏，抑菌圈直徑明顯增大。可見增加碳源有利于芽孢桿菌J-2產生抗真菌肽，但碳源的種類對抗真菌肽的產生沒有明顯影響。在產生抗真菌物質方面，碳氮比減小利于抗真菌物質產生，碳氮比增大更易產生抗真菌肽，原因是芽孢桿菌J-2在代謝過程中糖類的合成利于該抗真菌肽產生。

表3 碳源種類的影響

2.2.2 氮源種類從表4可以看出，氮源幾乎不影響抗真菌肽的產生，芽孢桿菌J-2可以利用無機氮源或有機氮源，有利于擴大生產抗真菌肽。

表4 氮源種類的影響

2.2.3 培養基種類從圖6可以看出，培養基種類對芽孢桿菌J-2發酵上清液抑菌圈直徑有一定的影響。LB、NB和基礎培養基氮源豐富，菌株生長良好，稀發酵液利于分離發酵產物，但明顯小于碳源培養基豐富條件下的芽孢桿菌J-2發酵上清液產生的抑菌圈直徑。芽孢桿菌J-2在碳源物質的PDL（200）、PDL（500）、PSL和PDP培養基中生長狀況優于在氮源豐富的培養基，且抑菌圈直徑要明顯大，所以用含豐富碳源的培養基利于其產生抗真菌肽。合成培養基和碳源天然培養基對芽孢桿菌J-2發酵上清液抑菌圈直徑的影響（表5）表明，芽孢桿菌J-2發酵上清液抑菌圈在天然碳源培養基培養直徑更大，抗真菌活性更強，利于抗真菌肽的產生，且成本低。綜上所述，正交實驗的培養基因素的4個水平宜采用含有豐富碳源的天然培養基PDL（200）、PDL（500）、PSL和PDP。

圖6 培養基種類對抑菌圈直徑的影響

表5 合成培養基與天然培養基對抑菌圈直徑影響

2.2.4 培養基初始pH圖7表明，培養基初始pH對芽孢桿菌J-2發酵上清液抑菌圈直徑有一定的影響。pH為7.0時，芽孢桿菌J-2發酵上清液抑菌圈直徑、抗真菌活性均達到最大，此條件有利于抗真菌肽的產生。pH為6.0、8.0、9.0時，芽孢桿菌J-2發酵上清液抑菌圈直徑、抗真菌活性無明顯的變化。pH為5.0時，抑菌圈直徑明顯減小，抗真菌活性明顯減弱，不利于抗真菌肽的產生。說明培養基初始最佳pH為6.0、7.0、8.0、9.0。

圖7 培養基初始pH對抑菌圈直徑的影響

圖8 發酵溫度對抑菌圈直徑影響

2.2.5 發酵溫度通過圖8可以看出，發酵溫度對芽孢桿菌J-2發酵上清液抑菌圈直徑的影響不大，溫度可以影響酶反應速率，但當培養溫度超過40℃時，抑菌圈直徑及其抗真菌活性將明顯下降，故37℃為最佳發酵溫度。

2.2.6 發酵時間從圖9可以看出，芽孢桿菌J-2發酵上清液產生的抑菌圈直徑在18～30 h時逐漸增大，而后隨發酵時間增加而逐漸減小。說明正交實驗的發酵時間因素的4水平以18、24、30、36 h為宜。

圖9 發酵時間抑菌圈直徑影響

2.2.7 芽孢桿菌J-2產生抗真菌肽發酵條件優化5因素對芽孢桿菌J-2產抗真菌肽的綜合影響及極差分析如表6、表7所示。影響結果由大道小順序為培養基、裝液量、發酵時間、接種量、培養基初始pH。以芽孢桿菌J-2發酵上清液產生的抑菌圈直徑大小作為衡量指標，經極差分析，得到關系圖（圖10），表明培養基為PDL（200）、pH7.0、發酵時間24 h、接種量9%、裝液量為150 mL時，所得抑菌圈直徑的和較其它水平下大，溫度為30～40℃時影響最小。因此抗真菌肽的較佳發酵條件為500 mL的錐形瓶中加入150 mL初始pH為7.0的PDL（200）培養基，接入9%的液體菌種，在37℃條件下發酵24 h。

表6 因素對芽孢桿菌J-2產生抗真菌肽的綜合影響

表7 極差分析結果①

圖10 發酵上清液抑菌圈直徑總和與各水平之間的關系

3 小結

1）通過形態觀察和染色、16SrDNA序列同源性分析等方法鑒定出從鹿糞便中分離出的菌株為枯草芽孢桿菌J-2。通過正交優化實驗，得出芽孢桿菌

J-2產生抗真菌肽的水平由多個因素共同決定的，芽孢桿菌J-2抗真菌肽最佳發酵條件為500 mL的錐形瓶中加入150 mL初始pH為7.0的PDL（200）培養基，接入9%的液體菌種，在溫度為37℃條件下發酵24 h。

2）本研究是在實驗室條件下運用搖床發酵芽孢桿菌產生抗真菌肽，并將其培養基組成和培養發酵條件進行了初步優化，若想得到更優的發酵條件，還需在此基礎上進一步優化。

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（本文責編：陳偉）

Research on Identification of Bacillus J-2 from Deer Feces and Fermentation Conditions of Antifungal Peptide

ZHAI Yi，LIANG Xiao-bo
（Institute of Food Safety，Kunming University of Science and Technology，Kunming Yunnan 650500，China）

In this study，with a strain of bacillus from deer feces as the test strains，we identified it as Bacillus subtilis J-2 by morphology，gram stain，spore stain，physiological and biochemical experiments，and it is analyzed，compared and identified by 16S rDNA sequence at the molecular level.the major factors which impact Bacillus J-2 generating antifungal peptides is analyzed by orthogonal optimization experiments，the optimum fermentation conditions of Bacillus J-2 generating antifungal peptides is derived，in 500 mL erlenmeyer flask is added 150 mL initial pH 7.0 PDL（200）medium access 9%liquid spawn，at the temperature of 37℃for fermentation.24 h.

Bacillus；Identification；Antifungal peptides；Fermentation

S852.61

A

1001-1463（2015）04-0011-07

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.04.004

2015-03-03

國家自然科學基金“Rib蛋白在羅伊氏乳桿菌腸道粘附中的功能研究”（31360022）

翟藝（1990—），女，山東青島人，碩士，主要從事菌種分離鑒定、發酵條件優化、蛋白純化及表達研究工作。聯系電話：（0）18314341075。E-mail：761671135@qq.com

梁小波（1974—），男，陜西咸陽人，副教授，博士，主要從事細菌細胞表面蛋白的功能研究工作。聯系電話：（0）13211649827。E-mail：xbliangkmust@hotmail.com