油菜COR基因的克隆及原核表達

張騰國，郭艷峰，陳瓊瓊，夏小慧

（1.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州 730070；2.蘭州城市學院，甘肅蘭州 730070）

油菜COR基因的克隆及原核表達

張騰國1，郭艷峰1，陳瓊瓊1，夏小慧2

（1.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州 730070；2.蘭州城市學院，甘肅蘭州 730070）

以冬油菜隴油6號葉片為材料，利用RT-PCR法克隆到油菜COR基因編碼區序列，全長390 bp。將其與大腸桿菌表達載體pET-30a連接，構建原核表達載體pET-30a-COR，并轉化大腸桿菌BL21，經IPTG誘導表達后，SDS-PAGE檢測結果表明該基因表達了1個約14.3 kD的蛋白，為進一步研究目的蛋白的結構和功能提供了實驗基礎。

隴油6號；COR基因；克隆；原核表達

植物為了維持正常的生長和發育，需要不斷的感知和適應外界環境的變化。低溫是主要的環境脅迫因素之一，當受到低溫脅迫時，絕大多數植物需要經過一段低溫馴化（cold acclimation）過程以獲得對低溫的耐受能力。在植物響應低溫脅迫的馴化過程中，體內發生著許多生理生化和分子變化［1］，包括細胞和組織結構的變化、新陳代謝過程的變化、基因表達水平的變化等［1～3］，其中以低溫激活或抑制基因的轉錄最為重要。擬南芥中受低溫調節的基因占到了基因組的4%～20%［4］，其中有一類低溫脅迫響應基因COR（for cold responsive），其啟動子區有干旱反應元件DRE/ CRT，擁有共同的核心基序（CCGAC）。擬南芥中有幾種COR基因（cold responsive genes），其中COR15a基因編碼一個Mr為15 000的多肽，轉基因研究表明，在-8～-4℃的范圍內，含有COR15am的原生質體比不含有COR15am的原生質體更具有抗凍性，且COR15a的表達能增加原生質膜的低溫穩定性（cryostability）［5］。除了COR15a以外，還有COR66、COR47和COR78等低溫反應基因。在低溫馴化期間，這幾個基因也能表達。COR15a與它們的協同表達可明顯提高植物的抗寒性［6］。

人們對COR基因協同表達進行了大量的研究,發現了它們的轉錄激活因子CBF，Stockinger等從擬南芥中分離得到了能夠結合干旱反應元件DRE/ CRT的轉錄因子DREB1/CBF［7］。CBF基因家族的3個成員可以被低溫脅迫短暫而迅速的誘導［8，9］，誘導的CBF轉錄因子可以結合到COR基因啟動子順式作用元件上，激活COR基因的表達。

從擬南芥中分離得到1個組成型表達的轉錄因子ICE1（inducer of CBF expression 1），ICE1基因編碼類似MYC的bHLH轉錄因子，在低溫脅迫響應途徑中，ICE1作為CBFs的上游因子，可特異地結合到CBF3啟動子的MYC作用元件，激活CBF3的表達并誘導CBF/DREB1下游基因的轉錄表達。組成型過量表達ICE1可以增強低溫馴化過程中CBF3、CBF2以及COR基因的表達，增強轉基因植株的低溫耐受能力，ICE1突變體可以減弱低溫對CBF3及受CBFs轉錄因子控制的COR基因的誘導表達［4］。以上研究表明，由ICE1→CBF→COR組成的低溫響應轉錄網絡在植物低溫馴化過程中發揮著重要的作用。

油菜是重要的油料作物，白菜型油菜（Brassica campestris.L）新品種隴油6號是一種超強抗寒性品種，適于極端低溫為-30～-20℃的旱區、寒區種植。本研究以隴油6號油菜為材料，克隆了ICE1→CBF→COR低溫響應轉錄網絡中的COR基因，并在大腸桿菌中進行了表達，以期為植物抵御低溫脅迫的作用機制補充新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

以隴油6號油菜為供試材料。將隴油6號油菜種子播種到含有混合營養土的小塑料盆內，置于室溫條件下培養28 d左右，然后轉入4℃冰箱冷處理24h，剪取油菜葉片，直接用于RNA的提取。

原核表達載體pET30a由西北師范大學生命科學學院分子生物學實驗室保存，克隆載體pTG19-T、T4 DNA連接酶購自于捷瑞公司，Premix Ex Taq DNA Polymerase、限制性內切酶購自于TaKaRa公司，Trans5α感受態細胞購自于全式金公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉錄選取生長良好的隴油6號油菜幼嫩葉片，按照Trizol試劑說明書進行總RNA的提取，提取的RNA用PrimerScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）逆轉錄試劑盒（TAKARA公司）合成cDNA。放置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 油菜COR基因編碼區的克隆根據本實驗室已擴增得到的油菜COR基因CDS區設計引物，上游引物CORYHBD-U1：5’-TCCGAATTCATGGCTATGTCTTTCTC-3’（下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點），下游引物CORYHBD-D1∶5’-GGCGTCGACTCATGCCTTGTAGTGT-3’（下劃線序列為SalⅠ酶切位點）。以cDNA為模板，擴增COR基因CDS序列，擴增產物經純化后連接到pTG19-T載體上，轉化Trans5α感受態細胞，篩選陽性克隆，經PCR確認后，送北京六合華大測序。

1.2.3 原核表達載體pET30a-COR的構建及轉化利用限制性內切酶EcoRⅠ和SalⅠ，對測序正確的pTG19-T-COR重組載體和表達載體pET30a分別進行雙酶切。酶切產物用T4 DNA連接酶連接，構建重組表達載體。構建好的重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，過夜培養，藍白斑篩選后挑取白斑提取質粒，經PCR與酶切驗證為陽性克隆后，送北京六合華大測序。測序正確的重組質粒命名為pET30a-COR。

1.2.4 含有重組表達質粒大腸桿菌的誘導表達將經過序列分析的含有融合表達質粒pET30a-COR的重組菌30 μL接種至3 mL含1%葡萄糖的LB培養液（含50 μg/mL Kan）中，37℃振搖過夜。取過夜培養物200 μL接種于20 mL含1%葡萄糖的LB培養液（含50 μg/mL Kan）中，劇烈振搖至OD600為0.6～1.0時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37℃誘導表達，5 h后收集2 mL菌液，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，檢測表達產物。用轉化空白質粒載體的大腸桿菌BL21作為陰性對照。

1.2.5 表達產物的SDS-PAGE電泳檢測收集的菌液以12 000 rpm離心5 min，菌體用無菌水吹懸，12 000 rpm離心，棄去上清液，用50 μL pH 7.4的PBS懸浮，加入等體積的2×SDS loading-buffer［100 mM Tris.c1（pH 8.0）、4%SDS、200 mM巰基乙醇、20%甘油、0.2%溴酚蘭］混勻，水浴煮沸5 min，用微量進樣器上樣20 μL，打開電源，濃縮膠中用60 V電壓，電泳至溴酚蘭進入分離膠，把電壓提高到100 V，繼續電泳至溴酚蘭到達凝膠底部。取下凝膠用蒸餾水沖洗，用凝膠5倍體積的考馬斯亮蘭染色液（45 mL甲醇∶45 mL水∶10 mL冰醋酸中溶解0.25 g考馬斯亮蘭）浸泡凝膠，放在平緩搖動的平臺上室溫染色1 h。用脫色液在脫色搖床上脫色，其間更換脫色液3～4次。待背景完全脫凈后，將凝膠浸入蒸餾水中終止脫色。

2 結果與分析

2.1 隴油6號總RNA的提取

通過對實驗操作技術的不斷改進，使用Trizol試劑從隴油6號油菜葉片中提取得到了高質量的總RNA產物，樣品的28S和18S rRNA條帶清晰，無DNA和蛋白質污染（圖1）。

圖1 油菜總RNA提取電泳圖

2.2 油菜COR基因CDS區的克隆

應用特異引物CORYHBD-U1和CORYHBD-D1進行PCR擴增，得到了1條390 bp大小的單一條帶（圖2）。測序結果表明，該序列與已得到的油菜COR基因編碼區是完全一致的。測序結果如下：

圖2 油菜COR基因PCR擴增結果電泳圖

利用DNAStar軟件，將油菜COR基因與其他植物中克隆得到的響應環境脅迫有關的COR基因編碼區（CDS序列）輸入MegAlign軟件，用Clustal方法進行序列同源性比對。結果發現：油菜COR與多種植物的COR基因有較高的同源性，與擬南芥AtCOR15B、白菜BrCOR15、薺菜CbCOR15a、油菜BnCOR115的同源性分別為74.6%、76.4%、71.1%、86.2%（圖3）。因此可以判斷，擴增產物為油菜COR基因片段。

圖3 油菜COR基因與其他植物COR基因同源性

2.3 融合表達載體pET30a-COR的構建與PCR鑒定

將重組質粒pTG19-T-COR分別用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，得到目的基因片段，與同樣雙酶切處理的原核表達載體pET30a連接，得到融合表達載體pET30a-COR。構建好的重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21，過夜培養，從過夜培養的LB培養基中挑選白色菌落，提取質粒DNA，用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶得到390 bp左右的片段（圖4），與預期的片段相符。測序結果表明，所測序列為油菜COR基因390 bp的正確閱讀框架，沒有移碼突變。該重組質粒命名為pET30a-COR。

圖4 重組表達質粒pET30a-COR酶切分析

2.4 重組表達產物的SDS-PAGE電泳檢測

重組質粒pET30a-COR經IPTG誘導后，在大腸桿菌BL21中進行表達。SDS-PAGE電泳（圖5）顯示，存在1條融合蛋白誘導表達的條帶，而誘導的轉化空載體未出現目的蛋白帶。表明重組質粒pET30a-COR在大腸桿菌BL21中誘導表達了油菜COR蛋白。

圖5 表達產物的SDS-PAGE電泳圖

3 討論

1）冷誘導基因的表達水平與CBF基因的表達水平有很大的線性關聯，CBF基因表達水平越高，冷誘導基因的表達水平就越強［10］。CBF轉錄激活因子的AP2氨基酸序列能夠特異性的識別并結合COR基因啟動子中的CRT/DRE元件，調控植物體內相關的基因表達，COR基因在植物受低溫誘導下是持續表達的，而CBF基因的表達是瞬時產生的，CBF基因的誘導表達可能作為低溫反應中信號傳遞的一個早期的信號放大事件，其體內葉綠素、可溶性糖、游離脯氨酸的含量都明顯高于正常生長下的植株，說明CBF基因促進功能蛋白的合成，激發其調節的下游COR基因的表達積累［11］。

2）由ICE1→CBF→COR組成的低溫響應轉錄網絡在植物低溫馴化過程中發揮著重要的作用。油菜中與擬南芥AtCOR15同源的基因還沒有克隆得到，根據已經克隆得到的植物COR15基因序列，從隴油6號油菜克隆得到了全長390 bp的COR基因編碼區，測序結果與已獲得的油菜COR基因CDS區序列是完全一致的，同時對該基因在大腸桿菌中進行了表達，并得到了體外表達產物。下一步將對表達產物進行純化，以純化產物為抗原制備COR蛋白抗體，對該基因的功能在蛋白水平做進一步研究。

［1］THOMASHOW M F.Plant cold acclimation：Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms［J］.Annu. Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.1999，50：571-599.

［2］THOMASHOW M F.Arabidopsis thaliana as a model for studying mechanisms of plant cold tolerance［M］.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994：807-834.

［3］VISWANATHAN C，ZHU J K.Molecular genetic analysis of cold-regulated gene transcription［J］.Philos.Trans. R.Soc.Lond.B.2002，357：877-886.

［4］LEE B，HENDERSON D，ZHU J.The Arabidopsis Cold-Responsive Transcriptome and Its Regulation by ICE1［J］.Plant Cell，2005，17：3 155-3 175.

［5］LIN C，THOMASHOW M F.DNA sequence analysis of a com plementary DNA for cold regulated A rabidopsis gene cor15 and characterization of the COR 15 polypeptide［J］.Plant Physiology，1992，99：519-525.

［6］JAGLO OTTOSEN K R，GILMOUR S J，Zarka D G et al.Arabidopsis CBF1 over expression induces COR genes and enhances freezing tolerance［J］.Sci.1998，280：104-106.

［7］STOCKINGER E J，GILMOUR S J，THOMASHOW M F.Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domaincontaining transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94：1 035-1 040.

［8］GILMOUR S J，ZARKA D G，STOCKINGER E J，et al.Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step incold-inducedCORgeneexpression［J］.Plant，1998，16：433-442.

［9］MEDINA J，BARGUES M，TEROL J，et al.The Arabidopsis CBF gene family is composed of three genes encoding AP2 domain-containing proteins whose expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration［J］.Plant Physiology，1999，119：463-469.

［10］UEMURA M，STEPONKUS P L.Effect of cold acclimation on the incidence of two forms of freezing injury in protoplasts isolated from rye leaves［J］.Plant Physiology，1989，91（3）：1 131-1 137.

［11］KNIGHT H，VEALE E L，WARREN G J，et al.The sfr6 mutation in Arabidopsis suppresses low-temperature induction of genes dependent on the CRT/DRE sequence motif［J］.The Plant Cell Online，1999，11（5）：875-886.

（本文責編：鄭立龍）

Cloning and Prokaryotic Expression of Brassica campestris COR Gene

ZHANG Teng-guo1，GUO Yan-feng1，CHEN Qiong-qiong1，XIA Xiao-hui2
（1.School of Life Sciences，Northwest Normal University，Lanzhou Gansu 730070，China；2.Lanzhou City University，Lanzhou Gansu 730070，China）

Afull-length ofCOR gene is cloned byRT-PCR fromLongyou 6（Brassica campestris L.），the gene encodingarea of COR is 390 bp.It is connected with the E.coli expression vector pET-30a.A recombinant prokaryotic expression vector pET30a-COR is constructed and transformed into E.Coli BL21，after IPTG induction，SDS-PAGE showed that the gene express an approximately 14.3 kDprotein.For the further studyon the structure and function oftarget protein provides an experimental basis.

Longyou 6；COR gene；Cloning；Prokaryotic expression

Q753；S565.4

A

1001-1463（2015）04-0001-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.04.001

2015-03-31

國家自然科學基金（31460099、31160089）；甘肅省自然科學基金（1208RJZA268）

張騰國（1971—），男，甘肅會寧人，教授，博士，主要從事抗逆生理及分子生物學研究工作。E-mail：zhangtengguo@163.com