肺炎嗜衣原體包涵體膜蛋白Cpn0147誘導單核細胞分泌TNF-α和IL-8

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(衡陽市中心醫院檢驗科，湖南 衡陽 421001)

肺炎嗜衣原體包涵體膜蛋白Cpn0147誘導單核細胞分泌TNF-α和IL-8

吳華，卿文衡，劉軍，張黎黎

(衡陽市中心醫院檢驗科，湖南 衡陽 421001)

目的探討肺炎嗜衣原體(Cpn)包涵體膜蛋白Cpn0147誘導人單核細胞分泌炎癥因子的分子機制。方法用去除內毒素活性的不同濃度Cpn0147重組蛋白(1.0、10.0、30.0和50.0 μg/mL)刺激THP-1細胞0～48 h，ELISA檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-8(IL-8)的分泌水平；實時定量PCR檢測TNF-α和IL-8 mRNA的表達；用Toll樣受體2(TLR2)和TLR4中和抗體處理THP-1細胞，或采用TLR2和TLR4 siRNA沉默其表達，ELISA檢測THP-1處理前后TNF-α和IL-8分泌的變化。結果Cpn0147可誘導THP-1細胞表達TNF-α和IL-8的mRNA和蛋白；同時，不同時間點Cpn0147對TNF-α和IL-8的誘導水平有所不同，Cpn0147作用2～6 h后即可誘導TNF-α和IL-8分泌，12 h時達到峰值，隨后逐漸下降。采用TLR2和TLR4中和抗體封閉THP-1細胞后，TNF-α和IL-8分泌水平明顯減少，采用TLR2和TLR4 siRNA干擾其表達后，TNF-α和IL-8的分泌也得到了類似的結果。結論Cpn0147 可能通過TLR2和TLR4介導TNF-α和IL-8分泌。

肺炎嗜衣原體； Toll樣受體2； Toll樣受體4； 腫瘤壞死因子-α； 白介素-8

肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumonia,Cpn)是一種嚴格細胞內寄生、具有獨特發育周期的原核細胞型微生物。作為一種常見的呼吸系統感染因子，Cpn除可引起呼吸道的急、慢性感染、支氣管炎和哮喘等呼吸系統疾病外，還和動脈硬化等多種慢性疾病相關[1]。Cpn的致病機制目前尚未完全明了，但其感染所致的炎癥反應是多種疾病的發病基礎。研究表明，衣原體包涵體膜蛋白在致病過程中發揮重要作用。它不但可激活單核/巨噬細胞、內皮細胞而發揮促炎作用，同時也可通過TLR2和TLR4誘導T細胞增值，并能促進衣原體對宿主細胞的黏附、侵襲，或參與其免疫逃避等過程[2,3]。因此，研究包涵體膜蛋白的功能，對了解其在衣原體致病中的作用具有重要意義。Cpn0147是本課題組鑒定出的一種包涵體膜蛋白。前期研究表明，Cpn0147基因高度保守，并具有良好的免疫原性[4]，但其對宿主細胞是否具有促炎活性目前尚未完全明了，本研究旨在觀察體外重組蛋白能否誘導單核細胞分泌細胞因子，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑pGEX-6p-2載體原核表達重組菌由南華大學病原生物學研究所保存；人單核細胞THP-1購自ATCC。HRP標記的兔抗小鼠IgG、Amicon? Ultra-15蛋白超濾管購自Millipore；抗TLR2和TLR4中和抗體購自Novus Biologicals；Ni-NTA Spin Kit購自Qiagen公司；TNF-α和IL-8 ELISA檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。RPMI-1640培養基、胎牛血清購自Invitrogen；TLR2和TLR4 siRNA購自Santa Cruz。siRNA轉染試劑盒購自Qiagen。

1.2無內毒素的Cpn0147的制備與細胞培養按照本課題組前期方法對Cpn0147進行大規模誘導表達[4]。利用去內毒素純化柱過柱后，采用蛋白超濾管對其進行濃縮、測定濃度后低溫儲存備用。THP-1細胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，4.5 mg/mL L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養基中，于37 ℃，5% CO2條件下培養。2～3天換液一次，待細胞生長至密度為80%時，根據不同的實驗目的，細胞加入不同濃度的1.0、10.0、30.0和50.0 μg/mL作用0～48 h。

1.4細胞因子檢測細胞經Cpn0147處理結束后，離心棄上清，采用連續凍融2次以充分裂解細胞。1 000 rpm離心10 min后，獲取上清測定TNF-α和IL-8含量。操作方法按照試劑盒提供的雙抗體夾心法進行。通過測定450 nm處的吸光度值，并根據標準曲線計算分泌至細胞外的TNF-α和IL-8含量。

1.5實時定量PCR檢測TNF-α和IL-6 mRNA表達根據試劑盒操作步驟提取細胞總RNA，并取3 μg的RNA進行逆轉錄，將獲得的cDNA進行實時定量PCR。本文所用引物如下：TNF-α上游引物為5′-GCCCAGGCAGTCAGATCATC，下游引物為5′-CGGTTCAGCCACTGGAGCT-3′;IL-8上游引物為5′-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT-3′；下游引物為5′-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3′；GAPDH上游引物為5′-ACCAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′，下游引物為：5′-TGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′，在定量PCR儀(ABI 7500)上按以下程序擴增：95 ℃ 2 min，隨后按照以下程序擴增40個循環：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。PCR結束后計算各處理組中HO-1的相對表達量，計算公式：2-ΔΔCt，ΔΔCt=實驗組(CtTNF-α/IL-8-CtGAPDH)-對照組(Ct TNF-α/IL-8-CtGAPDH)。

1.6細胞轉染siRNA轉染前，THP-1細胞更換為無血清培養基同步18h，隨后將其接種于6孔板中(密度約為5×105/mL)。siRNA轉染按照Qiagen公司的試劑盒操作步驟進行，將100 nmol/L TLR2或TLR4 siRNA或對照siRNA與轉染試劑混合后孵育18 h。隨后更換為完全培養基用于下一步研究。

1.7 Western blot 采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl pH7.4，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，1% SDS)裂解細胞，并用Bradford法于595 nm波長處測定蛋白濃度。取等量蛋白經8%～10% SDS-PAGE后，轉印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，分別加入一抗和HRP標記二抗孵育，ECL顯影。

2 結 果

2.1 Cpn0147誘導THP-1細胞TNF-α和IL-8 mRNA的表達THP-1細胞基礎狀態下TNF-α和IL-8表達量很低。當分別給予1.0、10.0、30.0和50.0 μg/mL Cpn0147刺激細胞8 h后，實時定量PCR結果顯示TNF-α和IL-8 mRNA表達量隨著Cpn0147濃度的遞增而增加(圖1)。

2.2 Cpn0147誘導THP-1細胞分泌TNF-α和IL-8

ELISA結果顯示，未經刺激的THP-1細胞TNF-α和IL-8分泌水平很低。經不同濃度重組Cpn0147刺激后12 h后，細胞上清中TNF-α和IL-8分泌水平顯著增高，其中50 μg/mL Cpn0147作用后，TNF-α和IL-8含量分別達(486.34±33.62)pg/mL和(125.47±16.08)pg/mL(圖2)。

圖1 不同濃度Cpn0147誘導THP-1細胞表達TNF-α和IL-8 mRNA 與對照組(0 μg/mL)相比，*：P<0.05，**：P<0.01

圖2 不同濃度Cpn0147誘導THP-1細胞分泌TNF-α和IL-8 與對照組(0 μg/mL)相比，*：P<0.05，**：P<0.01

2.3 Cpn0147誘導TNF-α和IL-8依賴持續的轉錄和翻譯不同濃度的RNA合成抑制劑放線菌素(ActD)和翻譯水平的抑制劑放線菌酮(CHX)預處理THP-1細胞后，ELISA結果顯示，TNF-α和IL-8分泌顯著降低(圖3)。

圖3 放線菌素和放線菌酮對Cpn0147誘導THP-1細胞分泌TNF-α和IL-8的影響 與Cpn0147(50 μg/mL)相比，*：P<0.05

2.4 Cpn0147不同時間誘導TNF-α和IL-8分泌

不同時間點Cpn0147對TNF-α和IL-8的誘導水平有所不同，Cpn0147作用2～6 h后即可誘導TNF-α和IL-8分泌，12 h時達到峰值，隨后逐漸下降(圖4)。

圖4 Cpn0147不同時間誘導TNF-α和IL-8分泌

2.5 TLR2和TLR4中和抗體抑制TNF-α和IL-8分泌THP-1細胞與5 μg/mL TLR2或TLR4抗體預孵育1 h，隨后加入50 μg/mL Cpn0147刺激12 h，結果顯示TLR2和TLR4中和抗體處理后，TNF-α和IL-8分泌水平明顯降低(圖5)。

圖5 TLR2和TLR4中和抗體對Cpn0147誘導THP-1細胞分泌TNF-α和IL-8的影響 與Cpn0147(50 μg/mL)相比，*：P<0.05

2.6沉默TLR2和TLR4表達下調TNF-α和IL-8分泌采用siRNA轉染THP-1細胞，分別使其沉默TLR2和TLR4表達(圖6A)。隨后加入50 μg/mL Cpn0147刺激12 h，結果顯示RNA干擾TLR2和TLR4表達后，TNF-α和IL-8分泌水平明顯降低(圖6)。

3 討 論

圖6 TLR2和TLR4 siRNA對Cpn0147誘導THP-1細胞分泌TNF-α和IL-8的影響 與對照siRNA(Con)相比，*：P<0.05

相對其他致病性較強的病原微生物(如沙眼衣原體)而言，Cpn毒力相對較低，其感染人體后并不直接導致嚴重的病理損傷。但如果Cpn慢性持續性感染后，可誘導宿主細胞產生多種促炎細胞因子以及炎性相關介質的產生，從而造成持續的炎癥反應[5]。Cpn0147為本課題組近期鑒定出來的一種包涵體膜蛋白，它定位于包涵體上，并且具有非常強的抗原性和免疫原性[4]。包涵體膜是宿主細胞進行物質和信號轉導發生的重要場所，其膜蛋白參與了衣原體的生長與致病過程[3]。由于炎癥是機體感染Cpn后所產生的一種免疫反應，它在發揮保護性防御反應的同時，也參與了Cpn所致的病理損傷[6,7]。為檢測Cpn0147是否為一種炎癥誘導物，本研究采用去除內毒素的純化重組蛋白Cpn0147以不同劑量、不同作用時間體外刺激單核細胞系THP-1，采用ELISA和實時定量PCR對TNF-α和IL-8蛋白以及mRNA的表達進行了觀察。結果顯示，Cpn0147與陰性對照組相比，可顯著誘導TNF-α和IL-8的產生，并呈現一定的劑量依賴關系，在1～50 μg/mL范圍內，隨著Cpn0147蛋白濃度的增高，TNF-α和IL-8分泌水平也逐漸升高。并且在50 μg/mL Cpn0147作用8～12 h后，培養上清中TNF-α和IL-8水平達到最峰值，然后逐漸下降。而采用RNA合成抑制劑放線菌素和翻譯水平的抑制劑放線菌酮處理后，TNF-α和IL-8的分泌明顯降低，這表明Cpn0147誘導其分泌依賴持續的轉錄和翻譯。TNF-α是具有多種生物學效應的促炎細胞因子之一，在炎癥反應過程中出現最早，能通過與靶細胞膜上的受體結合后，可實現其抗感染與免疫調節功能，同時還可以進一步促進IL-lβ和IL-6的合成以增強組織細胞敏感性。此外，也有研究證實高膽固醇高脂血癥男性患者頸動脈斑塊內可以檢測到高濃度的Cpn和TNF-α，這也提示Cpn感染以及TNF-α與心腦血管疾病有關[8]。IL-8是CXC 家族重要的趨化因子，它可誘導中性粒細胞粘附并滲出至炎癥部位，最終促進中性粒細胞產生呼吸爆發，釋放各種蛋白水解酶和產生大量的氧自由基，參與局部炎癥部位[9]。

衣原體感染后，機體免疫系統主要通過Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)對其進行識別。有研究顯示，衣原體熱休克蛋白60可能通過TLR4/MAPKs途徑誘導血管平滑肌細胞增生[10]，在識別Cpn過程中，TLR2可能發揮更重要的作用[11]。 為了進一步觀察Cpn0147誘導TNF-α和IL-8分泌是否與TLR有關，本研究首先采用TLR2和TLR4中和抗體預處理細胞，結果顯示通過抗體封閉TLR2和TLR4后，TNF-α和IL-8分泌顯著降低。隨后采用siRNA沉默TLR2和TLR4后，也得到了類似的結果。目前有關Cpn重組蛋白與TLR的關系，還存在爭議，其原因主要在于重組Cpn0147制備過程中雖然有被內毒素污染的可能[6]，但本研究在純化Cpn0147過程中，采用了去內毒素純化柱進行純化，并采用鱟試劑對純化產物進行了檢測，其水平在60 pg/mL以下。這表明Cpn0147被內毒素污染的可能性很小。

總之，Cpn所致炎癥反應是一種復雜的生理和病理過程，一方面它是機體清除衣原體感染所必須，另一方面，過度的炎癥反應也是導致病理損傷的重要因素。在該過程中，各種細胞因子網絡的平衡直接決定了炎癥反應的最終結局。如何在兩者之間尋求平衡是今后研究工作所面臨的復雜問題。

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Chlamydophilapneumonia-DerivedInclusionMembraneProteinCpn0147InducesMonocytesSecretionofTNF-αandIL-8

WU Hua,QING Wenheng,LIU Jun,et al

(Theclinicallaboratory，CenterHospitalofHengyangCity;Hengyang,Hunan,421001,China)

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of the inclusion membrane protein Cpn0147 on the secretion of cytokines in monocytes.MethodsCultured THP-1 cells were stimulated with different concentration of endotoxin-free recombinant inclusion protein (1.0,10.0,30.0 and 50.0 μg/mL) for 0～48 h.Secretion of TNF-α and IL-8 were detected by ELISA,expression of the mRNA was measured by real-time PCR.In addition,cells were preincubated with Toll-like receptor 2(TLR2) or TLR4 neutralizing antibody,or transfected with siRNA for TLR2 and TLR4,secretion of TNF-α and IL-8 were detected by ELISA.ResultsCpn0147 could induce THP-1 cells the secretion of TNF-α and IL-8,and the expression of mRNA.The production of TNF-α and IL-8 varies with time intervals,the ELISA results indicated secretion of cytokines appeared after 2～6 h of stimulation,peaked at 12 h and then decreased.Pre-incubation of TLR2 or TLR4 neutralizing antibody significantly abrogate Cpn0147-induced cytokines production,similar results was also obtained by RNA interference of TLR2 and TLR4.ConclusionCpn0147 can induce TNF-α and IL-8 secretion via TLR2 and TLR4.

Chlamydophila pneumonia; Toll-like receptor 2; TLR4; TNF-α; IL-8

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.004

2015-09-10；

2015-11-10

湖南省衛生廳科技計劃項目(B2013-132).

*通訊作者，E-mail：Wuhua924@163.com.

R392.12

A

(此文編輯：秦旭平)