胃癌患者血清miR-20a的表達及其與臨床病理特征的關系

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(1.南華大學醫學院腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第一醫院腫瘤外科)

·基礎醫學·

胃癌患者血清miR-20a的表達及其與臨床病理特征的關系

楊瑞瑞1，向夢琴1，周秀田1，扶云1，徐海帆2，陳卓2，游琴1，王佩華1，曾敏1，徐迎暉1，曾希1*

(1.南華大學醫學院腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第一醫院腫瘤外科)

目的探討胃癌初診患者血清miR-20a的表達情況及其與臨床病理特征的關系。方法采集45例原發胃癌初診患者血清，應用實時定量PCR(qRT-PCR)，加入cel-miR-39作為數據標準化指標，檢測血清miR-20a的表達量。結果胃癌患者血清中miR-20a表達與胃癌分化程度、TNM分期及淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。低分化組血清miR-20a表達水平明顯高于中分化組和高分化組。miR-20a在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者血清中的表達水平明顯高于Ⅰ期，有淋巴結轉移組明顯高于無淋巴結轉移組。miR-20a的表達與患者的性別、年齡無明顯相關性。結論胃癌患者血清miR-20a表達與胃癌分化程度、臨床分期及淋巴結轉移相關，可能用于胃癌早期診斷和病情監測。

胃癌； 血清標志物； miR-20a； 實時定量PCR

國際癌癥研究機構最新數據顯示，全球每年胃癌新發病例為10萬例，占所有癌癥新發病例的8.9%，僅次于肺癌、乳腺癌和結、直腸癌。每年因胃癌而死亡的病例為75萬例，占癌癥相關死亡的9.7%，僅次于肺癌。而全球有將近50%的胃癌診斷來源于中國，且胃癌發病年齡逐漸趨于年輕化[1]。因胃癌早期無明顯癥狀，就診時80%患者已處于中晚期，治療效果及預后差，5年生存率極低。由于傳統的胃鏡檢查不易普及，并且部分患者不適宜行該項檢查。因此，尋找新型的非侵入性的且具有較高敏感性和特異性的胃癌早期診斷分子標志物是目前亟待解決的難題。循環miRNA作為腫瘤無創診斷分子標志物的研究已成為腫瘤早期診斷研究中一個非常重要的研究方向[2]，近幾年來研究者們發現循環miRNA在許多腫瘤中扮演著類似癌基因或抑癌基因的角色，并已表明循環miRNA具有成為新型腫瘤分子標志物的最佳條件[3-4]。

研究發現，miR-20a與人類腫瘤關系密切，在宮頸癌、前列腺癌、卵巢癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中表達顯著上調，并和腫瘤的生長、遷移侵襲、浸潤及預后相關[5-8]。Li等[9]研究發現miR-20a在胃癌細胞系和組織中表達均上調，其高表達可以增強胃癌細胞增殖、遷移、侵襲能力。本課題組在之前的研究中建立了一定規模的腫瘤血清樣本庫，并在不斷完善[10]。本研究在此基礎上，應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對胃癌初診患者血清中miR-20a表達情況進行檢測，結合患者的臨床病理特征，分析miR-20a表達水平與胃癌臨床病理特征之間的關系，探討血清miR-20a在胃癌診斷和病情監測中的意義。

1 材料與方法

1.1血液樣本的收集及血清總RNA的提取選擇南華大學附屬第一醫院臨床診斷的原發胃癌患者，征得患者同意，在治療前采集清晨空腹靜脈全血4 mL至血清采集管中，室溫下靜置1 h后離心 (4 ℃，1 200 g，10 min)。為進一步去除細胞碎片，離心后將上層血清移至一個新的EP管，再次進行離心(4 ℃，12 000 g，5 min)。然后使用miRNeasy Serum/Plasma Kit 試劑盒(QIAGEN)，按說明書步驟提取血清總RNA，于-80 ℃保存備用。所有患者經術后病理診斷確診為原發胃癌。胃癌臨床分期采用AJCC第七版胃癌TNM分期標準[11]。

1.2逆轉錄以20 μL逆轉錄反應體系，采用qRT-PCR逆轉錄試劑盒miScript Ⅱ RT Kit(QIAGEN)轉錄血清總RNA為cDNA，操作步驟及注意事項嚴格按照miScript Ⅱ RT Kit試劑盒說明書進行。反應條件為：37 ℃，60 min，充分活化試劑中的逆轉錄酶，逆轉錄；95 ℃，5 min，抑制逆轉錄酶作用。反應結束后將反應體系在冰上放置5～10 min。然后加入200 μL無酶水到逆轉錄反應體系進行稀釋，充分混合。將cDNA進行分裝，避免反復凍融和污染，-20 ℃保存備用。

1.3實時熒光定量PCR 由于血清miRNA的檢測尚無公認可靠的內參，本課題采用加入外源性cel-miR-39作為內參[12]。使用相對定量法來測定miR-20a在胃癌患者手術前后的表達差異。miR-20a引物序列如下，F：5′- UAA AGU GCU UAU AGU GCA GGU AG-3′,R:5′- GCT AAA GTG CTT ATA GTG CAG GT-3′。實時熒光定量PCR使用的是miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒(QIAGEN)，總反應體系為10 μL，其中2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix為5 μL，10×miScript Universal Primer 量為1 μL，10×miScript Primer Assay 1 μL，RNase-free water 2 μL，Template cDNA 1 μL。PCR擴增條件為：95 ℃，15 min；94 ℃，15 s，55 ℃，30 s，70 ℃，30 s，40個循環，內參及待測miRNA分別設3個復孔，同時添加溶解曲線，溫度從55～95 ℃，在溫度逐漸攀升的過程中對熒光強度的變化進行實時的檢測，使用美國illumina公司Eco熒光定量PCR儀檢測。

1.4數據篩選和統計分析采用Illumina Eco熒光定量PCR系統配套軟件對采集的原始熒光數據進行相對定量分析。每一次檢測都加入等量外源性C.elegans miR-39(cel-miR-39)作為數據歸一化標準。為了使結果更加真實可靠，每一個樣本相對應的miRNA均進行了三次PCR擴增，對所得的三個復孔的Ct值取算數平均值即為該miRNA擴增的最終Ct值，計算出△Ct(△Ct=CtmiR-20a-Ctcel-miR-39)，根據△Ct值相對定量，比較分析目的miR-20a在不同胃癌患者血清中的表達水平，采用相對表達量(Relative expression)表示[13]。

采用SPSS 18.0對實驗數據進行處理，兩組比較采用t檢驗，3組或以上比較用單因素方差分析。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 qRT-PCR檢測血清miR-20a表達的可靠性分析通過qRT-PCR檢測胃癌初診患者血清中miR-20a的表達。圖1顯示：實時熒光定量PCR的擴增曲線標準、平臺期前呈指數增長，提示擴增效率理想。溶解曲線存在陡峭變化段、只存在一個溶解峰、無肩峰、且溶解峰在同一位置，提示miR-20a引物特異性好、不形成引物二聚體、擴增有高度特異性，能正確地檢測胃癌患者血清中miR-20a的表達。

2.2血清miR-20a表達與胃癌臨床病理特征的關系以胃癌患者血清中miR-20a表達值的中位數(median value=0.135)為臨界值將其分為低表達組和高表達組[13-14]，miR-20a的表達值小于0.135為低表達，大于等于0.135則為高表達。結果顯示miR-20a在45例胃癌患者血清中有22例低表達(48.9%)，23例高表達(51.1%)。采用軟件分析發現胃癌患者血清miR-20a的表達與患者性別、年齡(60歲為界)、腫瘤大小(3 cm為界)無明顯關系(P>0.05)；然而，單因素方差分析顯示血清miR-20a的表達受腫瘤分化程度和患者臨床分期的影響(P<0.05)。此外，低分化組血清miR-20a的表達明顯高于中分化組及高分化組(P<0.05)，并且在臨床分期中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血清miR-20a的表達水平顯著高于I期(P<0.05)；同時在有淋巴結轉移組的胃癌患者中血清miR-20a的表達要明顯高于無淋巴結轉移組(P<0.05)。以上結果提示，miR-20a在胃癌血清中表達與其分化程度、臨床分期及淋巴結轉移相關(表1，圖2)。

圖1 qRT-PCR檢測12例患者血清中mi-20a表達的擴增情況. 左為擴增曲線，中、右為溶解曲線

表1胃癌血清miR-20a的表達與其臨床病理參數的關系(n=45)

指標例數miR?20a低表達高表達P值性別0．258 男271413 女18810年齡(歲) ≥602612140．322 <6019109分化程度0．001 低分化22814 中分化1468 高分化981臨床分期 Ⅰ151140．000 Ⅱ1138 Ⅲ1037 Ⅳ954淋巴結轉移 有269170．000 無19136腫瘤大小 ≥3cm2712150．090 <3cm18108

3 討 論

近年來發現，血清或血漿中存在miRNA(循環miRNA)，這些miRNA在復雜的血液環境中能穩定存在，不被RNases降解，在室溫下較長時間放置和反復的凍融后，其中的miRNA量無明顯變化，并且還能耐受酸堿環境[15]。此外，不同健康個體的循環miRNA表達總體水平相當一致，沒有明顯個體差異，而疾病能明顯影響循環中miRNA的表達，使其具有良好的重復性和可比性[16]。由于其極高的理化穩定性和疾病相關性，血清或血漿miRNA作為疾病標志物的研究廣泛興起，特別是在腫瘤性疾病中。早在2008年Lawrie等人就發現在彌漫性大B細胞淋巴瘤病人血液循環中miR-155、miR-210、miR-21表達明顯上調，并且miR-21的表達與患者無復發生存明顯相關[17]。最近Antolin等[18]人用qRT-PCR檢測了57例乳腺癌患者和20例健康人群血清，發現miR-200c和miR-141在乳腺癌患者血清中表達明顯失調，且與乳腺癌患者預后不良相關，可以作為判斷預后的獨立因子。Fang等[19]研究表明血漿miR-24、miR-320a、miR-423-5p在結直腸癌患者循環血中明顯下調，且早期診斷敏感性較高，可用于結直腸癌患者早期診斷的標志物。綜上所述，這些研究表明循環miRNA很有潛力成為腫瘤早期診斷、預后判斷或復發監測的分子標志物。

然而，由于研究時間不長，循環miRNA的研究也存在一些問題。由于目前循環miRNA研究無公認可靠的內參，本研究中采取目前公認的加入外源性內參的方法對數據進行歸一化處理。此外，血清中miRNA含量相對組織和細胞中miRNA低得多，而且提取相對困難。本研究采用專為提取血清和血漿中miRNA開發的商品化試劑盒提取胃癌患者血清中miRNA。擴增曲線和溶解曲線證實提取miRNA質量理想，擴增特異性高，結果可靠。

圖2 45例胃癌患者血清miR-20a在不同分組中的表達分布情況

qRT-PCR是目前檢測miRNA最理想的方法。本研究采用qRT-PCR技術對胃癌患者血清中miR-20a進行檢測并結合臨床病理特征參數進行分析。實驗結果顯示miR-20a的表達與患者的年齡、性別及腫瘤大小無明顯相關性，而與胃癌的分化程度、臨床分期及淋巴結轉移密切相關，提示血清miR-20a水平可反映胃癌患者的病情進展情況，可能用于胃癌患者的病情監測。此外，在臨床分期中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者血清miR-20a的表達水平顯著高于I期。Wang等[14]在胃癌患者血漿中的研究也得到了類似的結果。這些研究表明血清miR-20a的改變是胃癌發生的早期事件，可能用于胃癌早期診斷，并有望成為胃癌早期診斷的分子標志物。本文為血清miR-20a用于胃癌的監測與診斷提供了良好的啟示和一定的實驗依據，但其效率如何、最終能否應用于臨床仍需擴大樣本進行進一步驗證。

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RelationshipBetweenSerummiR-20aExpressionandClinicopathologicalFeaturesinGastricCancer

YANG Ruirui,XIANG Mengqin,ZHOU Xiutian,et al

(CancerResearchInstitute,UniversityofSouthernChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between serum miR-20a expression and clinicopathological features in gastric cancer.MethodsSerum was collected in 45 primary gastric cancer patients who were untreated.Real-time quantitative PCR was adopted to detect the expression of miR-20a in serum using C.elegans miR-39 as an internal reference gene.ResultsIn this case,we analyzed the relationship between the serum miR-20a expression level and clinicopathological features.The results showed that expression of miR-20a was related with tumor differentiation,TNM stages and lymph node metastasis (P<0.05).The expression level of serum miR-20a was significantly higher in poorly differentiated gastric cancer patients than that in moderately differentiated and well differentiated gastric cancer patients.Moreover,miR-20a level was significantly higher in stage Ⅱ，Ⅲ and Ⅲ than stage Ⅰ,also higher in lymph node metastasis group than those patients without lymph node metastasis.ConclusionThe expression level of miR-20a is related with tumor differentiation,TNM stages and lymph node metastasis.MiR-20a is a candidate biomarker for detecting and monitoring gastric cancer.

gastric cancer；serum biomarker；miR-20a；qRT-PCR

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.001

2015-09-14；

2015-10-23

國家自然科學基金(81101643)資助.

*通訊作者，E-mail：zx397@126.com.

R735.2

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(此文編輯：蔣湘蓮)