固相萃取結合GC-O/MS分析威代爾冰葡萄酒中的香氣活性化合物*

馬玥，唐柯，徐巖，李記明，，于英，李蘭曉

1(工業生物技術教育部重點實驗室，江南大學生物工程學院釀酒微生物與酶技術研究室，江蘇無錫，214122)

2(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東煙臺，264000)

冰葡萄酒(icewine)又被稱作冰酒，是以自然結冰的葡萄為原料，采用特殊釀造工藝釀成的一種甜型葡萄酒［1-2］，酸甜平衡，香氣濃郁，呈現出蜂蜜、桃子、焦糖、杏等香氣特征［3-4］，其獨特的風味受到消費者的喜愛。

葡萄酒的風味在很大程度上取決于葡萄酒中的香氣成分，葡萄酒香氣也是葡萄酒品質中重要的評價指標。目前對冰酒的香氣研究主要集中在對不同國家、地域及不同葡萄品種的感官評價及揮發性成分的檢測上。加拿大及德國是主要的冰酒生產國，其中加拿大冰酒具有水果及花香味，而德國冰酒則具有明顯的堅果香［4-5］。在冰葡萄酒中已檢測到360余種揮發性成分，其中主要包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、萜烯類、硫化物、呋喃類、內酯類及芳香族化合物［6］。每一類甚至每一種化合物對于葡萄酒香氣貢獻都不相同，在這些化合物中，目前僅發現幾十種化合物對冰酒香氣有重要貢獻，其在不同的冰酒中也具有不同的表現［3］。目前我國冰酒的香氣研究則主要集中在揮發性化合物檢測上。王玉峰等采用溶劑萃取法在赤霞珠冰葡萄酒中獲得了38種揮發性成分，其中，乙酸乙酯、2-羥基丙酸乙酯、3-甲基丁醇、苯乙醇、2，3-丁二醇等含量較高［7］。李艷霞等采用固相微萃取技術，在威代爾冰酒中定性到59種揮發性成分［1］。王蓓等采用攪拌棒吸附萃取了威代爾冰酒中的揮發性成分，定性得到108種揮發性化合物［8］。

由于不同化合物的閾值不同，高含量的化合物其感官貢獻并不一定高，有些低閾值化合物在儀器上也無法檢測到。采用氣相色譜-聞香法(GC-O)結合氣相色譜質譜法(GC-MS)分析樣品中風味化合物可以用于尋找對樣品香氣貢獻較高的化合物。GC-O分析中常用到時間強度法、稀釋分析法與頻次法，又以稀釋分析法中的AEDA(aroma extraction dilution analysis)最為常見［9］。遼寧桓仁是中國重要的冰酒產區，所生產的威代爾冰酒具有怡人的香氣，但是其重要香氣成分仍不明確，因此探究形成冰酒感官特性的主要化合物并找出它們對于酒感官特性的貢獻對于冰酒的品質控制有重要意義。本研究以同一年份不同等級的威代爾冰酒為研究對象，采用固相萃取法(SPE)對香氣進行富集，在極性與非極性柱上通過GC-O結合GC-MS分析，來確定威代爾冰酒中重要的香氣成分，為指導冰酒的釀造及品質控制提供理論依據及支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2010年產威代爾冰葡萄酒(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司)，包括黑鉆、藍鉆、黃鉆3個不同等級。甲醇(上海安譜，色譜純)，乙醇(上海安譜，色譜純)，二氯甲烷(上海安譜，色譜純)，Na2SO4(上海國藥集團，分析純)，NaCl(上海國藥集團，分析純)，C5-C30烷烴標樣(天津光復精細化工研究所，色譜純)。

1.2 儀器與設備

Gerstel ODP2聞香裝置，德國 Gerstel公司;氣相色譜質譜聯用儀GC 6890N-MSD 5975，美國Agilent公司;萃取固相小柱為LiChrolut EN(0.5 g填料)，Merck公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 固相萃取方法

固相萃取柱潤洗活化后，以1 mL/min的速率上樣，樣品體積為60 mL。樣品吸附結束后，用20 mL超純水洗去柱子上可能殘存的糖、色素等小分子極性化合物，用10 mL二氯甲烷洗脫柱上吸附的香氣化合物。用氮氣將萃取有機相濃縮至250 μL，進行GC-O及GC-MS分析。

1.3.2 分析條件

GC-O分析:AEDA法。冰酒香氣萃取樣品用二氯甲烷按1∶2比例等比稀釋，通過GC-O在色譜柱上分析樣品，直到無法嗅辨到香氣化合物。每種物質的稀釋因子值為無法感知到該種香氣的最高稀釋度。每種樣品由2名經過半年以上聞香培訓的聞香員進行嗅辨分析，每個樣品的每個稀釋度進樣3次。3次中出現2次以上則保留該稀釋因子數值。香氣化合物通過使用DB-FFAP及HP-5MS兩種色譜柱來定性。

極性色譜柱為DB-FFAP(60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm，美國Agilent公司)。柱溫采用程序升溫，初溫50℃保持2 min，以6℃/min速率升溫至230℃并保持15 min;進樣口溫度為250℃;不分流進樣，進樣量 1μL;載氣為氦氣，流速 2mL/min。［0］

非極性色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm，美國 Agilent公司)。柱溫采用程序升溫，初溫50℃保持2 min，以5℃/min速率升溫至240℃并保持15 min;進樣口溫度為250℃;不分流進樣，進樣量 1μL;載氣為氦氣，流速 2mL/min。［0］

質譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度230℃;質量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.3 定性方法

香氣活性成分的定性通過與NIST 05質譜庫(Agilent Technologies Inc.)中標準譜圖匹配、與文獻報道的保留指數比對、香氣化合物香氣特征及標準品來確定。保留指數根據改進的Kovats法計算得到，在待測酒樣中加入C5-C30烷烴的混標，進GC-MS分離，通過烷烴的保留時間來計算未知化合物的RI。

2 結果與分析

2.1 GC-O嗅辨分析及GC-MS定性分析結果

利用SPE將不同等級的3種冰酒進行香氣濃縮，通過GC-O嗅辨分析及GC-MS定性分析共獲得65種對冰酒香氣有一定貢獻的化合物，結果如表1所示。3種同年份冰酒的極性柱總離子流色譜圖如圖1～圖3所示。其中檢測到酯類13種、醇類13種、萜烯類11種、芳香族化合物4種、酚類4種、內酯3種、酸類3種、硫化物3種、呋喃酮2種、醛酮類1種及未知化合物8種。

圖1 黑鉆級冰酒揮發性成分極性柱GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine(Black)separated by polar column

圖2 藍鉆級冰酒揮發性成分極性柱GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine(Blue)separated by polar column

圖3 黃鉆級冰酒揮發性成分極性柱GC-MS總離子流色譜圖Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine(Yellow)separated by polar column

由表1可以發現，同一年份3種等級的威代爾冰酒在聞香獲得的香氣化合物的種類上有一定差別，但最重要的香氣化合物(至少在一種酒中，其稀釋因子在81以上)基本相同，只是在其香氣強度上有一定差異，說明不同等級冰酒主要香氣成分構成上具有一致性，同時釀造工藝又對冰酒的香氣輪廓產生一定影響，也構成了不同等級冰酒所特有的香氣特征。這些重要的香氣化合物主要為酯類、醇類、萜烯類、硫化物及呋喃酮類化合物，包括異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、異戊醇、2-庚醇、1-庚醇、順式-玫瑰醚、3-甲硫基丙醛、脫氫芳樟醇、β-大馬酮、菠蘿酮及3種未知香氣化合物。

表1 威代爾冰酒香氣化合物AEDA聞香結果Table 1 Important aroma compounds in Vidal icewine detected by GC-O/MS

2.2 不同活性香氣化合物分析

2.2.1 酯類

酯類化合物是發酵類飲品中重要的香氣化合物，由醇及酸通過酯化反應產生。在葡萄酒中，酯類化合物可分為通過酶促反應產生的及在低pH環境下貯藏過程產生的兩類［10］。

續表1

3種不同等級的冰酒中共聞到13種酯類化合物，其主要表現為水果香。其中乙酸乙酯(蘋果)、異丁酸乙酯(菠蘿)、丁酸乙酯(甜瓜)、己酸乙酯(果皮)及辛酸乙酯(荔枝)在3種酒中稀釋因子不低于9。其中異丁酸乙酯在黑鉆級冰酒中稀釋因子可達243。這幾種酯類除了己酸乙酯外，其他幾種在Bowen等人對加拿大威代爾冰酒的重要香氣研究中沒有聞到［3］，這可能是由于地域性差異造成的。2-甲基丁酸乙酯，在三等級酒中皆有檢測到，但是在黃鉆級酒中香氣強度較弱，稀釋因子僅為1，而在黑鉆級酒中稀釋因子為243，該化合物有蘋果類香氣。

2.2.2 醇類

醇類化合物是酒中重要的風味化合物，醇類化合物是酒精發酵、氨基酸轉化及亞麻酸降解物氧化的主要產物。3種不同等級的冰酒中共聞到13種醇類化合物，其主要表現為植物清香。其中異戊醇、己醇、2-庚醇及1-庚醇對冰酒的香氣貢獻較為明顯，其稀釋因子不低于9，特別是異戊醇，在醇類化合物中對冰酒的香氣貢獻最大，其稀釋因子在3種酒中皆高于243，表現為類似指甲油一樣的清香。異戊醇在葡萄酒中的含量很高，其在冰酒中含量超過10 mg/L［5］。己醇表現為松子或堅果味，2-庚醇表現為蘑菇味，1-庚醇具有一種類似烘烤或油脂的味。

2.2.3 萜烯類

萜烯類化合物是葡萄酒中微量成分，具有較低的閾值，對葡萄酒的香氣貢獻較大。萜烯化合物的種類及含量與葡萄品種，土壤，氣候及葡萄栽培有很大關系［11］。

3種不同等級的冰酒中共聞到11種萜烯類化合物。在11種萜烯類化合物中，對香氣貢獻最大的是順式-玫瑰醚、β-大馬酮及脫氫芳樟醇，這3種香氣在3種酒中的稀釋因子皆高于27。順式-玫瑰醚表現為荔枝或玫瑰香，在黃鉆級的酒中稀釋因子最高，為81。β-大馬酮是威代爾冰酒中重要的香氣化合物，具有近似蜂蜜的甜香味，在3種級別的酒中稀釋因子皆不低于243，在黑鉆及藍鉆級別的酒中，其稀釋因子可達729。β-大馬酮在食品及葡萄酒香氣成分分析中已被廣泛報道，其具有極低的覺察閾值，僅為0.05 μg/L。順式-玫瑰醚及β-大馬酮皆具有怡人的甜香，在Bowen等人對加拿大威代爾冰酒的研究中同樣也發現其是重要的香氣化合物［3］。

2.2.4 硫化物

3個等級的威代爾葡萄酒中共聞到3種硫化合物，無法通過質譜檢測到，是由極性與非極性的保留指數定性及獨特的香氣特征匹配得到的，推測其為4-巰基-4-甲基-2-戊酮、2-甲基-3-呋喃硫醇及 3-甲硫基丙醛。其中貢獻最大的是3-甲硫基丙醛，表現為煮土豆味，在3種酒中的稀釋因子皆為81。4-巰基-4-甲基-2-戊酮的香氣特征是典型的黑醋栗芽孢味，2-甲基-3-呋喃硫醇則表現出一種堅果的香氣特征。

2.2.5 呋喃及內酯類

呋喃是食品中重要的風味化合物，在葡萄酒香氣的研究中，呋喃類化合物也被廣泛地報道，呋喃類化合物在食品中的形成途徑可分為3種，包括碳水化合物的熱解，美拉德反應及焦糖化反應［12］。內酯類化合物一般由對應的羥基酸在一定的條件下環化而成，4-烷基丁內酯(γ-lactones)及 5-烷基戊內酯(δ-lactones)是酒中常見的內酯類化合物，對香氣有積極貢獻［13］。

菠蘿酮(furaneol)，醬油酮(homofuraneol)是葡萄酒中2種重要的呋喃酮類香氣化合物，在紅葡萄酒、白葡萄酒及貴腐酒中皆有檢出，在貴腐酒中最高稀釋因子分別可達625及3 125［14-16］。在本研究中，菠蘿酮和醬油酮其香氣表現為焦糖類的甜香，菠蘿酮的稀釋因子最高為243，醬油酮的稀釋因子最高為27。美拉德反應是一種還原糖與氨基酸在一定的水分條件下發生的羰氨反應。在冰酒體系中，其糖含量很高，并且主要以還原糖為主，而總氨基酸含量也在1g/L以上［17］。因此，美拉德反應可能是造成冰酒中這兩種呋喃酮類化合物高香氣強度的原因。

研究僅通過MS定性獲得了3種內酯化合物，分別是γ-癸內酯、δ-癸內酯及桃醛，桃醛也稱丙位十一內酯。這3種內酯的香氣特征比較相似，皆表現為桃子或杏干。這3種內酯化合物在3種酒中，除了桃醛在藍鉆級的酒中的稀釋因子為27，其稀釋因子皆不高于9，但是這3種內酯可能是冰酒中杏桃味的重要來源。

2.2.6 其他類

除了酯類、醇類、萜烯類、硫化物、呋喃酮類及內酯類化合物，威代爾冰酒中還有芳香類、酚類、酸類及醛酮類化合物，也對其香氣存在一定貢獻。

威代爾冰酒中重要的芳香族化合物有苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、苯乙醇，其分別表現蘋果、花香、汽油及花香。曾有研究認為苯乙醇是威代爾冰酒的特征香氣［2］，但是從本結果來看，其稀釋因子不高于27，對冰酒的香氣貢獻并不顯著。

在3種不同等級的冰酒中還聞到4種酚類化合物。酚類化合物大多由橡木帶來，如橡木桶，橡木片甚至橡木塞。本研究中對冰酒香氣有一定貢獻的有愈創木酚及4-乙烯基愈創木酚，其表現為煙熏煙草類的刺激味，其在三等級的冰酒中稀釋因子均不低于3。實驗中僅聞到癸醛這一種醛酮類化合物對冰酒香氣存在貢獻，其表現為堅果味。酸是酒中重要的組成部分，其在酒的揮發性化合物含量中也占有較高比例，但是由于酸的覺察閾值也較高，其對冰酒的香氣貢獻只起到輔助作用。本研究結果顯示對冰酒香氣有貢獻的酸包括乙酸、辛酸及癸酸，3種酸中只有辛酸在3個等級的冰酒中皆有聞到，這3種酸的稀釋因子皆不高于3。

此外在3種不同等級的冰酒中還聞到8種未知化合物，其中7.24 min出現的奶油味，8.72 min出現的藍莓味及25.29 min出現的蜂蜜味具有較高的稀釋因子，在冰酒中較為重要。

3 結論

本實驗采用SPE結合GC-O及GC-MS分析，通過化合物在極性柱與非極性柱上的聞香結果，保留指數計算及質譜庫匹配來確定威代爾冰酒中的重要香氣化合物。實驗共檢測到65種對冰酒香氣有一定貢獻的化合物，包括酯類13種、醇類13種、萜烯類11種、芳香族化合物4種、酚類4種、內酯3種、酸類3種、硫化物3種、呋喃酮2種、醛酮類1種及未知化合物8種。其中酯類、醇類、萜烯類、硫化物、呋喃酮類及內酯類是威代爾冰酒中重要的香氣物質，主要表現為水果味，植物清香，花香，烘焙類香氣及甜香。在所有已知的香氣化合物中，異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、異戊醇、2-庚醇、1-庚醇、順式-玫瑰醚、3-甲硫基丙醛、脫氫芳樟醇、β-大馬酮及菠蘿酮對冰酒的香氣貢獻較大，其至少在一個級別的酒中最高稀釋因子不低于81。這幾種重要的香氣化合物在3個等級的冰酒中均能檢測到，但其香氣強度存在一定差異，表明釀造工藝可對冰酒的香氣輪廓產生一定影響。

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