18°P高濃釀造抗葡萄糖阻遏效應啤酒酵母的選育

郭立蕓

1(北京燕京啤酒股份有限公司技術中心，北京，101300)2(燕京啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京，101300)

啤酒高濃釀造(very high gravity，VHG)是指在啤酒釀造過程中糖化得到較高濃度的麥芽汁(15～18°P)，在發酵以后的工序中再用含CO2的脫氧水稀釋到正常濃度(10～12°P)的釀造技術。高濃釀造后稀釋技術，可以在投資和運行成本降低的情況下，增加產量20%～40%，實現高濃釀造有著顯著的經濟效益和社會效益［1］。但是由于VHG麥汁中存在更高濃度的可發酵性糖，導致發酵初期酵母細胞承受更高的滲透壓并且在發酵后期承受更高的乙醇毒性［2］。這些環境壓力在很大程度上限制了啤酒的發酵速度，酵母活性也明顯降低，同樣也降低了酵母的再次發酵活性(即酵母的重復利用)［3］，通過定向馴化選育耐高濃度的優良啤酒酵母可克服VHG釀造的劣勢。

啤酒發酵過程中，當麥汁中含有葡萄糖濃度高于0.2% ～0.5% 時，會限制酵母對麥芽糖的利用，只有低于此濃度限制才會解除［4］，但會降低酵母吸收利用麥芽糖和麥芽三糖的速率，造成發酵遲緩。而在超高濃發酵的麥汁中往往添加一定比例的啤酒糖漿，葡萄糖濃度會明顯提高，阻遏效應加劇，最終出現發酵不徹底等現象。因此，如果對酵母進行特定的篩選，使其能夠在較高葡萄糖濃度下提高對麥芽糖的利用速率，就可以在超高濃條件下提高發酵速度，縮短發酵時間，最終改善啤酒的品質［5-7］。2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)是葡萄糖的結構類似物，酵母吸收后不能利用，卻可以對酵母產生葡萄糖阻遏效應且不能解除［8］。因此，通過在以麥芽糖為惟一碳源并添加有2-DG的培養基中可實現抗葡萄糖阻遏酵母菌株的篩選。

本研究首先從燕京12°P釀酒酵母菌株出發，通過定向自然選育獲得18°P耐超高濃釀造菌株，在此基礎上，將18°P高濃酵母菌株在添加2-DG抑制劑的酵母浸膏蛋白胨平板上梯度培養、抗性平板分離初篩以及復篩，使這些突變株表現出耐受較高的滲透壓和酒精的能力，并適用于高濃釀造的抗葡萄糖阻遏效應的啤酒酵母菌株，并將該菌株進行100 L微釀啤酒發酵實驗，以期獲得1株高濃釀造抗葡萄糖阻遏效應啤酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實驗用菌株:12°P燕京釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株YJ0002，由燕京集團科研中心提供。

(2)實驗用培養基(北京陸橋技術有限責任公司生產):A-18°P高濃釀造定向馴化培養基:由14°P冷麥汁加糖漿調濃制成，保藏用固體培養基加入2%瓊脂粉制成;B-濃度梯度培養基:由18°P和25°P麥汁添加2%瓊脂，先將25°P培養基鋪入微傾放置的培養皿內，使鋪好的培養基在培養皿內一側成15°角，待凝固后水平放置培養皿，再將18°P培養基鋪入，直到培養基表面水平為止;C-酵母浸膏蛋白胨瓊脂培養基(YPM):酵母浸出物1%，蛋白胨2%，1%麥芽糖，0.05%的2-DG，2%瓊脂。

1.2 主要儀器設備

高效氣相色譜儀，美國Agilent6890型;啤酒檢測儀，奧地利Anton paar DMA4500型;酸度計，意大利哈納PH211型;色度計，德國DRLANGE;顯微鏡，日本OLYMPUS CX-41型;分光光度計，日本島津UV-2550;恒溫水浴鍋，美國Polyscience;水浴振蕩器，哈東聯HZS-H型;生化培養箱，日本三洋MIR254上海一恒LRH250;全溫振蕩器，哈東聯HZQ-Q型;酶標儀，美國Bio-rad model 550。

1.3 實驗方法

1.3.1 分析測定方法

雙乙酰、酒精度測定見《啤酒工業手冊》［9］;酵母死亡率測定采用亞甲基藍染色法［10］。

主要風味物質含量測定采用頂空氣相色譜法［11］;可發酵性糖測定采用高效液相色譜法［12］;AP酸化力測定見參考文獻［13］。

1.3.2 18°P超高濃釀造啤酒酵母的定向選育

1.3.2.1 18°P超高濃釀造啤酒酵母的馴化

將12°P燕京酵母YJ0002由斜面接入12°P無菌麥汁(25 mL)中，在25℃下150 r/min振蕩培養至對數生長期(大約36 h)。取對數生長期菌懸液培養液1 mL接種至18°P高濃馴化培養基中，并在25℃繼續振蕩培養，培養至對數期后，重復上述操作進行定向馴化，馴化至第11代。每代檢測對數期酵母細胞數和酵母細胞活性，確定性能良好代數的菌種，將菌種進行斜面保存。

1.3.2.1 耐18°P超高濃釀造啤酒酵母的篩選

將上述性能良好代數酵母菌選取1 mL培養液連續梯度稀釋涂布至18°P麥汁固體培養基平板上，選取較大菌落。將大菌落挑取1環放在裝有10 mL 18°P無菌麥汁的試管中，在25℃培養箱中培養24 h。再將活化菌液進行稀釋，將10-4菌液在18～20°P梯度平板上進行涂布。于25℃培養箱中培養48 h。在高濃區選取生長強壯的菌落，完成一次分離篩選。重復分離篩選10次，最后從高濃區選取生長迅速強壯的菌株移接在18°P斜面中保存備用。

1.3.3 超高濃抗葡萄糖阻遏效應酵母菌株的分離與篩選

1.3.3.1 抗葡萄糖阻遏效應突變株的分離

將選育出的18°P高濃釀造菌株菌懸液涂布于添加有0.05%的2-DG的YPM平板中，25℃培養2～3 d。將長出的菌落再在上述平板中劃線培養分離1次，找出單菌落進行單菌落分離。同時接種10 mL液體試管進行活化，采用梯度稀釋法分離單菌落。重復第3步，連續分離3代，選出最好菌落。

1.3.3.2 酒精耐受能力實驗

按表1所列酒精濃度將馴化菌株菌懸液在每個濃度中接入0.1 mL，每個濃度做2個平行，于25℃培養箱中培養10 d，觀察杜氏管中產氣情況。

表1 酒精含量分配表Table 1 Alcohol content distribution table

1.3.3.3 高通量篩選

將抗葡萄糖阻遏效應突變株活化24 h后接種0.2 mL到48孔板培養，然后使用酶標儀檢測其OD值，進行高通量篩選。

1.3.4 100 L微釀發酵實驗

將分離得到的抗葡萄糖阻遏效應的啤酒酵母菌株進行三角瓶發酵選育后，進行100 L微釀實驗。將挑選的最優菌和出發菌進行100 L啤酒小型發酵，麥汁濃度18.2°P，發酵溫度為(14±0.5)℃，接種酵母濃度為(20±5)×106個/mL。跟蹤檢測雙乙酰、酒精度、降糖情況、酵母數的變化。發酵結束后檢測發酵度、pH值、總酸、苦味質、AP值、風味物質等相關發酵指標。

2 結果與討論

2.1 18°P超高濃釀造啤酒酵母的定向選育結果

2.1.1 酵母細胞數及細胞活性檢測結果

以燕京12°P釀酒酵母(S.cerevisiae)YJ0002為對照菌株，經11代傳代定向馴化后，分別編記為 C1～C11傳代后，其在對數期酵母細胞數和酵母細胞活性見圖1。

圖1 18°P高濃釀造馴化各代數酵母細胞數(對數期)和細胞活性(AP)值Fig.1 The yeast count and acid power of C0-C11 under the very high gravity brewing

由圖1可知，馴化代數C1-C4階段，對數期酵母數緩慢增長，酵母細胞活性AP值略有增加，馴化代數C5-C8階段，對數期酵母數呈現基本穩定趨勢，同時，酵母細胞活性基本穩定，其中C8的酵母細胞數和酵母細胞活性表現良好。馴化代數C9-C11階段，酵母細胞數和細胞活性呈現降低趨勢。因此選取馴化代數C8階段進行梯度稀釋平板篩選。

2.1.2 定向馴化后的菌落及細胞形態

將經過10次篩選后的C8代菌株挑取少量用無菌水進行稀釋后，涂布于18°P麥汁培養基平板上，培養48 h后其菌落狀態和細胞狀態分別見圖2(稀釋10-4)。培養過程中發現馴化菌株較對照菌株菌落生長快、菌落大。

圖2 對照菌株和馴化菌株菌落形態照片(培養48 h)Fig.2 The colony morphology photograph of control stain and experimental strain

圖2表明馴化菌株適合在18°P麥汁培養基平板上生長，細胞在高滲透壓的條件下，仍保持很高的生理活性，菌落大而飽滿。而對照菌株則不適應在此濃度下生長。

從圖3可以看出，馴化過的酵母形態呈圓形，酵母形態飽滿正常，而對照菌株出現了大量形態異常的細胞。這表明未經馴化的對照菌株對高滲透壓、高酒精環境表現出了極大的不適應，高滲透壓與高酒精造成細胞變形。馴化后的菌株適應高濃環境，形態未見異常。

圖3 對照菌株和馴化菌株細胞形態照片(40×10倍)Fig.3 The cellular morphology of control stain and experimental strain

2.2 超高濃抗葡萄糖阻遏效應酵母菌株的分離與篩選結果

2.2.1 平板分離獲取抗葡萄糖阻遏效應啤酒酵母

將上述分離馴化得到的C8代酵母菌株連續梯度稀釋涂布于添加有0.05%的2-DG的YPM平板中，在稀釋梯度10-6和10-7條件下獲得抗2-DG的高濃釀造的單菌落酵母，生長情況如圖4所示。

圖4 YPM平板分離菌株培養照片(48 h)Fig.4 The Purification strain cultured on YPM culture medium

2.2.2 酒精耐受能力測試結果

將分離到的抗葡萄糖阻遏效應的啤酒酵母進行耐酒精實驗，培養10 d后的結果如表2所示。

從表2可以看出，馴化后的菌株在酒精濃度(乙醇體積分數)為13%的試管中仍有氣泡產生，證明馴化菌株能夠耐受13%的酒精濃度，而對照菌株的耐酒精濃度為10%。因此得出，經過馴化的菌株耐酒精能力能力提高了3%，最高可以耐受13%的酒精。

表2 耐酒精實驗結果Table 2 The results for ethanol resistance experiment

2.2.3 高通量篩選結果

將馴化菌株分離培養得到2 545個菌株，將其接種48孔板發酵，測其生長OD值。經過逐級篩選獲得30株菌進行量筒發酵(重復5次)，最終突變株G2和G9的降糖速度、乙醇生成、酵母增殖和死亡率表現出較好的穩定的突變性狀。

2.3 篩選菌株的發酵性能結果(100 L微釀)

2.3.1 酵母增殖、乙醇生成、發酵速率、雙乙酰檢測

在18°P高濃發酵過程中，對照菌株YJ0002和馴化菌株G2、G9的乙醇濃度、酵母增殖、雙乙酰還原和發酵速率隨時間的變化曲線如圖5～圖8所示。

圖5 酵母增殖曲線圖Fig.5 Yeast proliferation curve

圖6 發酵速率曲線圖Fig.6 Fermentation rate

圖7 酒精生成曲線圖Fig.7 The curve for ethanol production

從圖5～圖8可以看出:在18°P發酵過程中，酵母數的變化反應了酵母在超高濃麥汁中的生長與繁殖情況，對糖的利用率和最終的發酵度都有不可忽視的作用。馴化菌株酵母峰值明顯高于對照菌株。與對照菌株YJ0002相比，馴化菌株G2和G9表現出更快的發酵速率，發酵速率(發酵初期)分別提高了10.96%和15.11%，G2和G9菌株在發酵的第9天殘糖濃度達到4.5°P和4.46°P，較之于對照菌株發酵11d殘糖濃度4.61°P，分別縮短發酵時間42 h和50 h，因此可以提高高濃釀造的生產效率。發酵初期酒精的生成速率分別比對照菌株增加了10.52%和14.24%，雙乙酰是反映啤酒成熟度的指標，G2菌株和G9菌株的雙乙酰峰值高于對照菌株，這是由于G2和G9酵母數的增殖倍數比出發菌株大，導致雙乙酰前驅物大量合成的結果，與對照菌株相比，G2和G9菌株雙乙酰還原時間分別提前38 h和50 h。酵母數的變化反映了酵母在超高濃麥汁中的生長與繁殖情況，對糖的利用率和最終的發酵度都有不可忽視的作用。馴化菌株酵母明顯高于對照菌株。

圖8 雙乙酰還原曲線圖Fig.8 The curve for reduction of diacetyl

2.3.2 AP值的檢測結果

酸化力(AP)法被認為是評估酵母活性的有效方法之一［12］。AP值大小與酵母的發酵活性相關，特別是在極端環境下用來評價酵母活性。發酵結束后收集酵母泥檢測馴化菌株的AP值如圖9所示。

圖9 18°P發酵結束后 YJ0002、G2、G9的 AP值圖Fig.9 The acid power of YJ0002，G2，G9 after fermentation

從圖9可以看出，馴化菌株G2和G9的AP值均比對照菌株YJ0002高，這一結果表明G2和G9在傳代發酵過程中可以保持較高的活性。

2.3.3 風味物質的檢測結果

在18°P發酵結束后對照菌株YJ0002和馴化菌株G2、G9的啤酒風味物質檢測結果見表3。

表3 啤酒風味物質檢測結果 (單位:mg/L)Table 3 The results of flavor compound detection

從表3可以看出，相對于對照菌株 YJ0002，隨著麥汁濃度增加乙酸乙酯濃度顯著增加，高級醇濃度顯著降低，破壞了啤酒的風味協調性。這一結果與Piddocke等人［14］的研究結論相同。啤酒中的酯含量不能過高或過低，酯含量過高會有異常的香氣，過低又會使啤酒寡淡無味。因此啤酒中的酯含量要適當。

在18°P發酵過程中，突變株G2和G9發酵的啤酒表現出較低濃度的總酯和適宜濃度的總高級醇。并且G2和 G9生產的VHG啤酒的口感較 YJ0002有了顯著的改善。G2和G9生成的啤酒具有更加協調醇香和果味。馴化菌株G2和G9乙醛含量低于出發菌株，這表明馴化菌株對乙醛的還原能力強于出發菌株。啤酒中的乙醛含量過高會有生青味，因此要求菌株對乙醛的還原能力越強越好。

2.3.4 常規理化指標的檢測結果

發酵結束后，發酵液的pH、總酸、苦味質、酒精度和真實發酵度檢測結果見表4。

表4 理化指標的檢測結果Table 4 The chemical index result after fermentation

馴化后的菌株G2和G9發酵液的發酵度比對照菌株提高了6%和7%，其他指標基本與對照菌株YJ0002相近，基本上保持了對照菌株的優良性狀。

2.3.5 感官品評

將高濃發酵酒稀釋到10°P，組建由國家級品酒師2人、國家啤酒評委3人、公司級品酒師2人的品評小組，將小組平均成績記為樣品感官評價結果。對啤酒樣品進行感官特征、感官質量評價，表5為感官品評結果。

表5 感官品評結果Table 5 The rusults of sensory evaluation

從感官指標品評結果來看，菌株YJ0002有臭酵母味，而馴化菌株則G2和G9沒有。這是因為在后酵期酵母死亡率過高，酵母自溶所造成。

3 結論

本研究以釀酒酵母 YJ0002為出發菌株對其進行18°P定向馴化后，在添加2-DG的YPM分離抗葡萄糖阻遏效應酵母突變株，采用高通量進行初篩復篩，并進行微釀實驗驗證。定向傳代培養后C8代酵母表現出較好的酵母增殖和AP活性，分離得到的抗阻遏效應酵母突變株菌生長迅速，細胞在高滲透壓的條件下，仍保持很高的生理活性，菌落大而飽滿。經高通量篩選獲得的G2和G9兩株菌，在100L微釀發酵過程中，發酵速率、酵母增殖、風味物質較出發菌株有了明顯改善。

(1)分離得到的抗葡萄糖阻遏效應的超高濃啤酒酵母菌株最高可耐受13%的酒精濃度。

(2)突變株G2和G9的發酵初期的酒精生成速率分別比初始菌株YJ0002提高10.52%和14.24%。

(3)突變株G2和G9發酵速率(發酵初期)分別提高了10.96%和15.11%，分別縮短發酵時間42 h和50 h，發酵度分別提高了6%和7%。

(4)在發酵結束時突變株G2和G9的AP值較初始菌株YJ0002高，酵母細胞活性增加。

(5)相對于初始菌株YJ0002，在VHG條件下，突變株G2和G9生產的啤酒表現出較低濃度的乙酸乙酯和適宜濃度的高級醇，且G2和G9生成VHG啤酒的口感較YJ0002有了顯著的改善。感官品評G2和G9酵母菌株產酒風味:酯香較明顯;YJ0002有輕微酵母臭。

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