豬肉類罐頭食品中總DNA提取方法的比較*

楊彤暉，孟鎮(zhèn)，鐘其頂，仇凱，安麗艷，李志軍

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京，100015)

近年來，肉制品的摻假事件層出不迭，其中尤以低值肉類摻入冒充高值肉類最為嚴(yán)重。肉制品的真實(shí)性鑒別已經(jīng)成為行業(yè)內(nèi)關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。目前，動(dòng)物源性成分鑒別方法主要有蛋白質(zhì)鑒別［酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)，等電聚焦(IEF)，高效液相色譜(HPLC)等］［1-3］和分子學(xué)鑒別［聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，DNA 雜交等］［4-5］等。由于 DNA 較蛋白質(zhì)而言耐熱性強(qiáng)，不依賴于組織和細(xì)胞的類型，具有更高的種間多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，基于以物種間基因差異為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)鑒別方法已成為食品中動(dòng)物源成分鑒別的主要方法［6］。

對(duì)于深加工肉制品，如罐頭制品、肉干、肉骨粉等，由于經(jīng)過了繁雜的前處理和長(zhǎng)時(shí)間的高溫加工，使得DNA嚴(yán)重降解［7］。從這些深加工食品中提取足夠數(shù)量和質(zhì)量的DNA是進(jìn)行動(dòng)物源分子學(xué)鑒別的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。

目前，常用的DNA提取方法有SDS法，異硫氰酸胍法，CTAB法和試劑盒法［8］。本研究比較了EE101-02 DNA提取試劑盒、SDS法、CTAB法和異硫氰酸胍法對(duì)豬肉罐頭食品DNA的提取效果，并指出了適用于分子生物學(xué)研究的豬肉類罐頭食品中總DNA提取的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

7種豬肉類罐頭食品(表1)，從超市購買的鮮豬肉樣品作為陽性對(duì)照。

表1 豬肉類罐頭樣品Table 1 Canned pork samples

1.1.2 試劑

EE101-02 DNA提取試劑盒(easyPure genomic DNA提取試劑盒型，型號(hào)EE101-02，北京全式金生物技術(shù)有限公司);異硫氰酸胍法裂解液［5 mol/L GuSCN，0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1.3%Triton-X 100，0.02 mol/L EDTA(pH 8.0)］;CTAB 法裂解液［1%CTAB，0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.7 mol/L NaCl，0.01 mol/L EDTA(pH 8.0)］;SDS 法裂解液［1%SDS，0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.1 mol/L EDTA(pH 8.0)］;蛋白酶 K(20 mg/mL);V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1;TE 緩沖液(0.01 mol/L Tris，0.001 mol/L EDTA，pH 8.0);異丙醇;無水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15型高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司);Tgradient PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra公司);DYY-8C型高壓電泳儀(北京六一儀器廠);CV-1000型凝膠成像系統(tǒng)(法國VILBER LOURMAT公司)。

1.3 DNA提取方法

1.3.1 樣品前處理

分別取2g鮮豬肉和豬肉類罐頭樣品于10 mL離心管中，加入6 mL的無菌去離子水，上下顛倒充分混勻，9 000 g室溫離心5 min并棄去上清液。再加入6 mL的三氯甲烷，9 000 g室溫離心5 min并棄去上清液。然后再用無菌去離子水清洗樣品1次。

1.3.2 EE101-02 DNA提取試劑盒提取DNA

按照試劑盒說明書操作進(jìn)行。

1.3.3 異硫氰酸胍法

參考邵碧英［9］，何建文［10］的研究，并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取50 mg樣品于1.5 mL離心管中，加入200 μL TE，混勻;加入 400 μL裂解液，室溫放置30 min后，加400 μL V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1溶液，混勻;10 000 g室溫離心5 min，取上清液，加0.8倍體積異丙醇，室溫沉淀1 h;10 000 g室溫離心5 min，棄上清液;體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌1次，晾干;加入50 μL TE緩沖液，溶解沉淀。

1.3.4 CTAB法

參考 GB/T 21101-2007［11］，并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取50 mg樣品于1.5 mL離心管中，加入600 μL CTAB裂解液，65℃ 溫育30 min，每隔10 min振蕩混勻1次;10 000 g室溫離心5 min，吸取上清液至新離心管中，加400 μL V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1溶液，充分混勻;10 000 g室溫離心5 min，吸取上清液至一新離心管中，加0.8倍體積異丙醇，室溫下沉淀1h;10 000 g室溫離心10 min，棄上清液;70%乙醇洗滌1次，晾干;加入50 μL TE緩沖液，溶解沉淀。

1.3.5 SDS法

參考Kitano T的研究［12］，并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取50 mg樣品于1.5 mL離心管中，加入600 μL裂解液，并加入20 μL 5 mg/mL蛋白酶 K;55℃12 h水浴;在冰上放置30 min，10 000 g室溫離心10 min;轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管中，加400 μL V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1溶液，充分混勻;10 000 g室溫離心5 min，吸取上清液至一新離心管中，加0.8倍體積異丙醇，室溫下沉淀1h;10 000 g室溫離心10 min，棄上清液;70%乙醇洗滌1次，晾干;加入50 μL TE緩沖液，溶解沉淀。

1.4 PCR檢測(cè)

以4種方法提取的總 DNA為模板，參考文獻(xiàn)［13-15］，根據(jù)豬線粒體基因組(mtDNA)細(xì)胞色素b(Cytochrome b，Cyt b)基因和16S rRNA基因，選取通用引物(表2)進(jìn)行PCR反應(yīng)。每組反應(yīng)做2個(gè)平行試驗(yàn)。PCR反應(yīng)采用25 μL體系:10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，20pmol/uL 引物各1 μL，模板 DNA 2 μL，Taq DNA Polymerase 0.3 μL(1.5U)，MgSO4(50 mmol/L)1 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積。擴(kuò)增條件為:94℃ 3 min，94℃ 30s，相應(yīng)退火溫度(表2)30s，72 ℃ 30s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2 通用引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小Table 2 The sequences and products size of universal primers

2 結(jié)果與分析

使用表2中3對(duì)引物對(duì)4種方法提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1～圖3所示。

從圖1、圖2可以看出，對(duì)于鮮豬肉和7種罐頭樣品，異硫氰酸胍法提取的DNA，均能利用引物擴(kuò)增出244 bp和376 bp的片段，且條帶整齊明亮。相比較，EE101-02 DNA提取試劑盒提取的DNA，只有部分罐頭樣品的DNA可以利用引物擴(kuò)增出目的片段，且條帶暗淡微弱。對(duì)于CTAB法和SDS法提取的DNA，有少數(shù)罐頭樣品的DNA不能利用引物擴(kuò)增出244 bp和376 bp的目的片段。

圖1 使用引物L(fēng)2513/H2714(244 bp)擴(kuò)增4種方法提取DNA結(jié)果Fig.1 Amplification results of primer L2513/H2714(244 bp)

圖2 使用引物L(fēng)14181/H15149(376 bp)擴(kuò)增4種方法提取DNA結(jié)果Fig.2 Amplification results of primer L14181/H15149(376 bp)

從圖3可以看出，對(duì)于4種方法提取7種豬肉類罐頭的DNA，利用引物mcb398/mcb869進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大部分樣品電泳未見大小為472 bp的目的片段。而對(duì)于鮮豬肉，4種方法提取的DNA均能擴(kuò)增出目的片段。這是由于罐頭加工過程中，高溫高壓使DNA斷裂、降解，不易擴(kuò)增到大片段基因。但是對(duì)于云腿大片罐頭，CTAB法、SDS法和異硫氰酸胍法提取的DNA均可以擴(kuò)增出472 bp的目的片段，這是因?yàn)樵仆却笃揞^的殺菌條件是95℃下加熱100 min［16］，較低的殺菌溫度減少了DNA的破壞。

圖3 使用引物mcb398/mcb869(472 bp)擴(kuò)增4種方法提取DNA結(jié)果Fig.3 Amplification results of primer mcb398/mcb869(472 bp)

表3匯總了不同方法提取樣品DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。可以看出，對(duì)于同一樣品，不同方法提取DNA的效果差異明顯。

表3 四種方法提取各樣品總DNA PCR情況匯總Table 3 Amplification results of the total DNA extracted by four methods

表4列出了4種方法提取DNA的原理及其操作所需時(shí)間。綜上，對(duì)于豬肉類罐頭產(chǎn)品，異硫氰酸胍法提取DNA的質(zhì)量最好，可以滿足后續(xù)PCR試驗(yàn)的要求，且操作簡(jiǎn)便，花費(fèi)時(shí)間短。

表4 四種方法提取DNA的原理及操作時(shí)間Table 4 The principle and time of four DNA extraction methods

對(duì)以上樣品利用L14181/H15149擴(kuò)增其Cyt b部分序列，擴(kuò)增PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與Genbank中參考序列比對(duì)，結(jié)果顯示7種罐頭樣品與豬(Sus scrofa)(GenBank登錄號(hào):NC_000845.1)的相似度為98%。表明所用7種豬肉類罐頭含有豬源性成分。

3 討論

提取質(zhì)量合格的DNA是利用分子生物學(xué)方法鑒別肉制品動(dòng)物源成分的第一步，也是關(guān)鍵的一步。特別是對(duì)于肉類罐頭食品，由于加工過程中添加了調(diào)味料，并經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的高溫高壓殺菌過程，其DNA破壞程度要比一般加工食品更為嚴(yán)重［7，17-18］。動(dòng)物細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞中有數(shù)百個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體包含多份拷貝的DNA，在數(shù)量上遠(yuǎn)超核DNA，另外，線粒體DNA長(zhǎng)度遠(yuǎn)短于核DNA，這些特點(diǎn)使線粒體DNA適用于加工食品的分析［19］。本研究中，從所選7種豬肉類罐頭產(chǎn)品中都可以擴(kuò)增出最高376 bp的線粒體基因片段，但是當(dāng)目的片段增大到472 bp時(shí)，只有3種罐頭樣品可以擴(kuò)增出目的片段。

在DNA提取過程中，目前應(yīng)用最多的DNA提純方法仍然是傳統(tǒng)的酚三氯甲烷抽提法，主要是利用苯酚使蛋白質(zhì)變性，使蛋白質(zhì)溶于酚相，DNA溶于水相。但是使用苯酚有非常大的缺點(diǎn)。苯酚屬高毒類，對(duì)皮膚和黏膜有強(qiáng)烈的腐蝕性，能經(jīng)皮膚和黏膜吸收而造成中毒。而且由于實(shí)驗(yàn)使用的苯酚為商品酚，易被氧化產(chǎn)生醌、二酸，可破壞核酸的二酯鍵，并引起DNA鏈的交聯(lián)［20］。在本試驗(yàn)中，DNA的純化舍棄苯酚，直接采用三氯甲烷異戊醇體系，減少了操作時(shí)間，并降低了試驗(yàn)給操作人員帶來的安全風(fēng)險(xiǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用三氯甲烷異戊醇體系仍可以從豬肉類罐頭這種深加工食品中提純合格質(zhì)量的DNA。

4 結(jié)論

為了能在DNA受損嚴(yán)重的罐頭食品中提取到片段較大、質(zhì)量較好的DNA，使用PCR片段大小梯度擴(kuò)增手段對(duì)4種方法的提取DNA效果進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果顯示，異硫氰酸胍法在4種方法中提取DNA的效果最好，且操作簡(jiǎn)便，不需要水浴，提取時(shí)間短，成本低廉，可以滿足后續(xù)PCR試驗(yàn)的要求。

［1］ 劉萬臣，唐曉敏，崔建華，等.應(yīng)用等電聚焦電泳鑒別動(dòng)物肉種類的研究［J］.獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993(2):177-178.

［2］ Toorop R，Murch S J，Ball R O.Development of a rapid and accurate method for separation and quantification of myofibrillar proteins in meat［J］.Food Research International，1997，30(8):619-627.

［3］ Ayob M K，Ragab A A，Allen J C，et al.An improved，rapid，ELISA technique for detection of pork in meat products［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1989，49(1):103-116.

［4］ Buntjer J B，Lamine A，Haagsma N，et al.Species identification by oligonucleotide hybridisation:the influence of processing of meat products［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79(1):53-57.

［5］ 陳穎，吳亞君.基因檢測(cè)技術(shù)在食品物種鑒定中的應(yīng)用［J］.色譜，2011(7):594-600.

［6］ 李文靜，李燕俊.分子學(xué)方法鑒定肉制品種屬來源的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2009(3):151-158.

［7］ Besbes N，F(xiàn)attouch S，Sadok S.Comparison of methods in the recovery and amplificability of DNA from fresh and processed sardine and anchovy muscle tissues［J］.Food Chemistry，2011，129(2):665-671.

［8］ 張麗，楊蓮茹，吳紹強(qiáng).核酸提取方法的研究進(jìn)展［J］.中國動(dòng)物檢疫，2011(12):75-78.

［9］ 邵碧英，陳文炳，鄭騰，等.動(dòng)物產(chǎn)品中牛、羊源性成分多重PCR檢測(cè)方法的建立［J］.畜牧與獸醫(yī)，2004，36(3):7-9.

［10］ 何建文，韓建林，羅玉柱.利用不同方法從深加工牦牛肉產(chǎn)品中提取基因組DNA效果的比較［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010(10):162-167.

［11］ GB/T 21101-2007.動(dòng)物源性飼料中豬源性成分定性檢測(cè)方法 PCR方法［S］.

［12］ Besbes N，F(xiàn)attouch S，Sadok S.Differential detection of small pelagic fish in Tunisian canned products by PCRRFLP:An efficient tool to control the label information［J］.Food Control，2012，25(1):260-264.

［13］ Kitano T，Umetsu K，Tian W，et al.Two universal primer sets for species identification among vertebrates［J］.International Journal of Legal Medicine，2007，121(5):423-427.

［14］ Kocher T D，Thomas W K，Meyer A，et al.Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals:amplification and sequencing with conserved primers［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1989，86(16):6 196-6 200.

［15］ Verma S K，Singh L.Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application［J］.Molecular Ecology Notes，2003，3(1):28-31.

［16］ 楊邦英.罐頭工業(yè)手冊(cè)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2002.

［17］ Chapela M I A J，Sotelo C G，P E Rez-Mart I N R I，et al.Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned tuna for species identification［J］.Food Control，2007，18(10):1 211-1 215.

［18］ Mackie I M，Pryde S E，Gonzales-Sotelo C，et al.Challenges in the identification of species of canned fish［J］.Trends in Food Science ＆ Technology，1999，10(1):9-14.

［19］ Jocelyn E Krebs，Elliott S Goldstein，Stephen T Kilpatrick.Lewin基因X［M］.北京:科學(xué)出版社，2013.

［20］ 鮑毅新，孫波，張龍龍，等.對(duì)動(dòng)物組織DNA提取方法的改進(jìn)及PCR檢測(cè)［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009(3):317-321.