大孔樹(shù)脂處理對(duì)鱈魚(yú)蛋白酶解液中腥味物質(zhì)的影響*

常鈺菲，侯虎，李八方

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 山東，266003)

鱈魚(yú)，鱈屬魚(yú)類，是世界年捕撈量最大的深海魚(yú)。鱈魚(yú)中蛋白含量約16.5%，高于三文魚(yú)、鯧魚(yú)等魚(yú)類，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［1］。研究表明，水產(chǎn)蛋白酶解產(chǎn)物中廣泛存在著具有降血壓［2］、抗氧化［3-4］等特殊生理功能的多肽，還可用于牛磺酸、殼聚糖［5］等的制備，來(lái)源于海洋生物的活性肽，在功能食品的開(kāi)發(fā)中極具潛力。

但是，水產(chǎn)品普遍具有令人生厭的不良風(fēng)味，尤以腥味為主;此外，在制備酶解液時(shí)，由于酶解過(guò)程較難控制，酶解產(chǎn)物通常具有苦腥味，嚴(yán)重制約水產(chǎn)蛋白酶解液在食品方面的應(yīng)用［6］。因此，脫腥成為水產(chǎn)品加工及應(yīng)用領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

水產(chǎn)品脫腥方法主要分為物理脫腥、化學(xué)脫腥及生物脫腥三類，常見(jiàn)方法有活性炭吸附法、酸堿處理法及酵母發(fā)酵等［7］。活性炭吸附法在脫腥脫色方面有一定效果，但使蛋白質(zhì)損失較大;酸堿處理法會(huì)引入一定的試劑殘留;酵母等微生物發(fā)酵法，僅適于液態(tài)樣品［8］，且酵母粉的加入會(huì)引入異味。近年來(lái)，大孔樹(shù)脂因具有吸附性和篩選性，能有效吸附各類有機(jī)物質(zhì)，在不良風(fēng)味脫除方面的應(yīng)用逐漸興起［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)以大孔樹(shù)脂吸附脫腥為研究對(duì)象，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，以大孔樹(shù)脂型號(hào)為變量進(jìn)行樹(shù)脂初篩，選出對(duì)鱈魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物脫腥的最佳樹(shù)脂類型;以溫度、樹(shù)脂添加量及pH為變量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出該型大孔樹(shù)脂的最佳脫腥工藝，并通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及SPME-GC-MS分析確證該工藝可行、有效，為鱈魚(yú)蛋白酶解液在腥味脫除、功能性食品開(kāi)發(fā)等水產(chǎn)品加工應(yīng)用領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鱈魚(yú)購(gòu)自青島南山水產(chǎn)品市場(chǎng)。宰殺后的新鮮鱈魚(yú)，去除魚(yú)皮、內(nèi)臟及鰓部，取背部魚(yú)肉，制成肉糜，于-20℃冷凍保存。

枯草桿菌堿性蛋白酶(食品級(jí))，由南寧龐博試劑有限公司提供;牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，由賽默飛科技有限公司提供;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

001×7型大孔樹(shù)脂，山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司;D151、D201、D311型大孔樹(shù)脂，安徽三星樹(shù)脂科技有限公司;DA201-C型大孔樹(shù)脂，江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司;D4006、AB-8型大孔樹(shù)脂，南開(kāi)大學(xué)化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠;PHS-3C雷磁pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;SHA-B恒溫振蕩器，國(guó)華電器有限公司;722s可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;65 μm PDMS/DVB萃取纖維及HP-INNOWax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)氣相色譜柱，美國(guó)Supelco公司;GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鱈魚(yú)蛋白酶解液的制備

將鱈魚(yú)肉糜解凍，以20%為底物濃度加入至pH 10的緩沖液中，并加入0.15%枯草桿菌堿性蛋白酶，于55℃下攪拌酶解4 h，沸水浴中滅酶10 min，冷卻，于5 000 r/min離心20 min，取上清液待用。

1.3.2 大孔樹(shù)脂預(yù)處理［12］

將大孔樹(shù)脂用蒸餾水洗至出水無(wú)味，無(wú)細(xì)碎樹(shù)脂及雜質(zhì)。以0.5 BV無(wú)水乙醇浸泡24 h，蒸餾水反復(fù)洗凈至無(wú)氣味。以2 BV 4%HCl浸泡4 h，排去酸液，蒸餾水洗至中性;以2 BV 4%NaOH浸泡4 h，排去堿液，蒸餾水洗至中性。濕基保存，使用時(shí)抽濾脫水。

1.3.3 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附單因素實(shí)驗(yàn)

以經(jīng)脫腥處理后的鱈魚(yú)蛋白酶解液的腥味分值及多肽損失率為指標(biāo)，分別考察樹(shù)脂型號(hào)、溫度、樹(shù)脂添加量、pH對(duì)大孔樹(shù)脂脫腥效果的影響。

1.3.4 中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以酶解產(chǎn)物脫腥后的腥味分值和多肽損失率為響應(yīng)值，選取脫腥溫度(X1)、樹(shù)脂添加量(X2)、pH(X3)3個(gè)自變量，分別在3個(gè)水平上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，建立自變量與響應(yīng)值之間的回歸關(guān)系，求得最優(yōu)值并進(jìn)行驗(yàn)證，從而對(duì)大孔樹(shù)脂的脫腥工藝進(jìn)行優(yōu)化。共計(jì)17組試驗(yàn)，因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and coded levels in response surface model

1.3.5 脫腥效果評(píng)價(jià)

以大孔樹(shù)脂脫腥后的鱈魚(yú)蛋白酶解液的腥味分值和多肽損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

腥味分值由感官評(píng)定得來(lái)。感官評(píng)定小組由10名(5男5女)感官評(píng)定員組成，分別對(duì)大孔樹(shù)脂處理后的樣品進(jìn)行感官評(píng)定。評(píng)定室溫為25℃左右，評(píng)定過(guò)程中不得相互交流，樣品的評(píng)定之間有一定的時(shí)間間隔。以酶解原液作為參照(分值為6)，根據(jù)表2所列評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分，取平均值表示該樣品的腥味程度。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Sensory evaluation standard

多肽含量的測(cè)定:參照水解液中多肽含量的測(cè)定方法［13］，分別測(cè)定鱈魚(yú)蛋白酶解原液和經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂處理后的鱈魚(yú)蛋白酶解液中的多肽含量，多肽損失率計(jì)算:

式中，W0—鱈魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物中多肽含量;W1—大孔樹(shù)脂處理后的鱈魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物中的多肽含量。

1.3.6 SPME-GC-MS分離鑒定

將鱈魚(yú)蛋白酶解液及大孔樹(shù)脂最佳工藝處理后的酶解液分別通過(guò)固相微萃取法(SPME)進(jìn)行腥味物質(zhì)萃取，并通過(guò)GC-MS進(jìn)行分離及鑒定。

SPME:萃取纖維采用65 μm PDMS/DVB。

GC:色譜柱采用為 HP-INNOWax(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250℃;初始柱溫40℃，保持3 min，以8℃ /min的速度升溫至250℃，保持10 min;載氣為氦氣(He)，流量為 0.8 mL/min。不分流進(jìn)樣。

MS:電子轟擊(EI)離子源，離子源溫度250℃，電子能量70 eV，檢測(cè)器電壓為350 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

通過(guò)計(jì)算各物質(zhì)的Kovats指數(shù)，進(jìn)一步為物質(zhì)定性，并通過(guò)檢索Flavor數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.flavornet.org)、LRI＆ Odour數(shù)據(jù)庫(kù)(www.odour.org.uk)及文獻(xiàn)值［14］等，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行風(fēng)味描述。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹(shù)脂脫腥單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同型號(hào)大孔樹(shù)脂脫腥效果比較

以大孔樹(shù)脂型號(hào)為變量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，脫腥效果如圖1-a所示。由圖可知，就腥味分值而言，大孔吸附樹(shù)脂(DA201-C、D4006、AB-8)對(duì)腥味物質(zhì)的吸附能力高于離子交換樹(shù)脂(001×7、D151、D201、D311);就多肽吸附能力而言，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(001×7、D151)的吸附能力高于陰離子交換樹(shù)脂(D201、D311)，大孔吸附樹(shù)脂中，DA201-C吸附較多的多肽，多肽損失率最高，而在D4006型和AB-8型2種吸附樹(shù)脂作用下，多肽損失率較低。因此，從腥味分值和多肽損失率兩個(gè)角度綜合考慮，AB-8型大孔吸附樹(shù)脂可吸附較多的腥味物質(zhì)但又不至于損失大量多肽，脫腥效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取AB-8型大孔吸附樹(shù)脂作為最佳樹(shù)脂類型，用于后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 溫度對(duì)大孔樹(shù)脂脫腥效果的影響

由圖1-b可知，在15～55℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，經(jīng)AB-8型大孔樹(shù)脂吸附處理后的酶解液的多肽損失率呈上升趨勢(shì)，而腥味分值呈降低趨勢(shì)，且兩者的變化幅度均隨溫度升高而逐漸減弱。這表明，在一定范圍內(nèi)，升高溫度，可促使AB-8型大孔樹(shù)脂更多地吸附多肽，致使多肽損失率上升;相應(yīng)地，升高溫度也可促進(jìn)AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)不良風(fēng)味物質(zhì)的吸附，此外，溫度的升高有利于腥味物質(zhì)的揮發(fā)，2種作用可共同導(dǎo)致腥味分值的降低。從腥味分值和多肽損失率兩個(gè)角度綜合考慮，當(dāng)溫度介于25～45℃之間時(shí)，脫腥效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取25、35及45℃，作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中溫度的3個(gè)水平。

2.1.3 樹(shù)脂添加量對(duì)大孔樹(shù)脂脫腥效果的影響

由圖1-c可知，在2.0%～20.0%范圍內(nèi)，當(dāng)樹(shù)脂添加量增加時(shí)，酶解液的多肽損失率呈上升趨勢(shì)，腥味分值大幅下降，而當(dāng)樹(shù)脂添加量由10.0%增至20.0%時(shí)，腥味分值增幅很小，分值介于1.5～2.0之間，即表現(xiàn)為“腥味較弱”。這表明，在一定范圍內(nèi)，增加樹(shù)脂量可加大AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)鱈魚(yú)蛋白酶解液中多肽的吸附，致使多肽損失率升高;相應(yīng)地，樹(shù)脂量的增加也可促進(jìn)對(duì)腥味物質(zhì)的吸附，但當(dāng)樹(shù)脂添加到一定量時(shí)，繼續(xù)加大樹(shù)脂量，對(duì)腥味物質(zhì)的吸附因趨于飽和而無(wú)明顯變化。從腥味分值和多肽損失率兩個(gè)角度綜合考慮，當(dāng)樹(shù)脂添加量介于5% ～15%之間時(shí)，脫腥效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取5%、10%及15%，作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中樹(shù)脂添加量的3個(gè)水平。

2.1.4 pH對(duì)大孔樹(shù)脂脫腥效果的影響

由圖1-d可知，當(dāng)pH值由4升至9時(shí)，酶解液的多肽損失率均在15%上下浮動(dòng)，無(wú)明顯變化;而在pH值由4升至7時(shí)，腥味分值大幅降低，酶解液由“腥味偏重”變?yōu)椤靶任遁^弱”或“略有腥味”，當(dāng)pH值繼續(xù)升高時(shí)，腥味分值略微上升。這表明，pH值的高低對(duì)多肽吸附率影響甚微;對(duì)腥味而言，中性環(huán)境更利于AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)鱈魚(yú)蛋白酶解液中腥味物質(zhì)的吸附。從腥味分值和多肽損失率兩個(gè)角度綜合考慮，當(dāng)pH值介于6～8之間時(shí)，脫腥效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取6、7、8作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中pH的3個(gè)水平。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化大孔樹(shù)脂脫腥工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

采用Design-Expert 7.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)各因素進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，并應(yīng)用該軟件繪制各指標(biāo)與其他2個(gè)自變量的三維曲面圖。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別對(duì)腥味分值Y及多肽損失率W進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到回歸模型如下:

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of response surface model

由表4可以看出，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型顯著(P＜0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P值分別為0.053 1、0.080 5，均大于0.05)，這說(shuō)明此回歸模型理想，用方程Y和W擬合3個(gè)因素與腥味分值及多肽損失率之間的關(guān)系是可行的。對(duì)于腥味分值，其決定系數(shù)R2為0.973 5，校正決定系數(shù)Radj2為0.933 5，說(shuō)明該模型能解釋93.35%的響應(yīng)值。對(duì)于多肽損失率，其決定系數(shù)R2為0.993 0，校正決定系數(shù)Radj2為0.984 0，說(shuō)明該模型能解釋98.40%響應(yīng)值。

表4 腥味分值(Y)、多肽損失率(W)回歸模型方差分析Table 4 ANOVA on regression model of fishy odor value and polypeptide loss ratio

方差分析結(jié)果表明，X1、X2、X3、X12、X22和X32對(duì)腥味分值Y影響顯著，即溫度、樹(shù)脂添加量、pH三個(gè)因素均對(duì)腥味值有顯著影響;X1、X2、X3、X12、X1X3對(duì)多肽損失率影響顯著，即溫度、樹(shù)脂添加量、pH三個(gè)因素均對(duì)肽損失率有顯著影響，交互項(xiàng)溫度/pH對(duì)肽損失率也有顯著影響。

2.2.2 各因素對(duì)響應(yīng)值的影響

各因素對(duì)響應(yīng)值的影響如圖2(a～c)所示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，腥味分值隨著溫度、樹(shù)脂添加量、pH的增加出現(xiàn)下降，但繼續(xù)增大3者用量反而導(dǎo)致腥味分值的增加，這說(shuō)明腥味分值Y具有低點(diǎn)。如圖2(d～f)所示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，多肽損失率W隨著溫度、樹(shù)脂添加量、pH的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明這3個(gè)因素均有最佳值。

圖2 各因素交互效應(yīng)三維曲面圖Fig.2 3D surface images of interaction effects

2.2.3 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附脫腥最優(yōu)工藝驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 7.0軟件，按照優(yōu)化目標(biāo)，將腥味分值Y設(shè)置為最小“minimize”，將多肽損失率W設(shè)置為最小“minimize”，得到最優(yōu)工藝為溫度25℃、樹(shù)脂添加量13.23%、pH 8.0，此工藝下腥味分值Y預(yù)測(cè)為1.9，多肽損失率W預(yù)測(cè)為17.62%。按照該最佳工藝條件重復(fù)試驗(yàn)3次，得到平均腥味分值Y為2.0，多肽損失率W為17.89%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定、可靠。

2.3 SPME-GC-MS驗(yàn)證脫腥前后腥味物質(zhì)的變化

對(duì)鱈魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物及AB-8型大孔樹(shù)脂在最佳工藝下脫腥后的酶解產(chǎn)物分別進(jìn)行SPME-GC-MS分離鑒定，得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流色譜圖如圖3所示，所示揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定結(jié)果見(jiàn)表5。

圖3 脫腥前后總離子流色譜圖對(duì)比Fig.3 Total ions chromatogram of hydrolysate before and after deodorization

由圖3可知，在該GC-MS條件下得到的總離子流色譜圖的分離度較好。由表5可知，經(jīng)AB-8型大孔樹(shù)脂最佳工藝處理后，鱈魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物中的8種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)被脫除，且其他物質(zhì)的豐度均有一定程度降低。被脫除的風(fēng)味化合物中，1-戊烯-3-醇、己醛、2-己烯醛及異戊酸冰片酯等是水產(chǎn)品中常見(jiàn)的腥味來(lái)源［15］:1-戊烯-3-醇主要賦予鱈魚(yú)蛋白酶解液以蘑菇、肉味和溫和油脂風(fēng)味，具有低閾值和高風(fēng)味活性的特點(diǎn)，被證明對(duì)北極蝦［16］等水產(chǎn)品的風(fēng)味構(gòu)成亦有較大貢獻(xiàn);己醛、己酸甲酯等，主要賦予鱈魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物以青草味、清香味;異戊酸冰片酯(bornyl isovalerate)是鱈魚(yú)蛋白酶解液土腥味的主要來(lái)源［17］。因此，SPMEGC-MS結(jié)果表明，經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂最佳工藝處理后的鱈魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物，其腥味有所減弱，該方法可有效脫除鱈魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物中的腥味物質(zhì)。

表5 GC-MS及Kovats指數(shù)鑒定結(jié)果Table 5 Identification results of GC-MS and Kovats indices

3 結(jié)論

(1)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AB-8型大孔吸附樹(shù)脂脫腥效果最佳;其他條件相同，當(dāng)溫度介于25～45℃時(shí)，當(dāng)樹(shù)脂添加量介于5% ～15%時(shí)，當(dāng)pH在6～8范圍內(nèi)時(shí)，脫腥效果較好。

(2)AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)鱈魚(yú)蛋白酶解液的最佳脫腥工藝為:溫度25℃、樹(shù)脂添加量13.23%、pH 8.0。此工藝下脫腥得到的酶解液腥味分值為2.0，多肽損失率為17.89%，與軟件預(yù)測(cè)值接近。

(3)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及SPME-GC-MS分析表明，該脫腥工藝有效、可靠，可作為AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)鱈魚(yú)蛋白酶解液的最佳脫腥工藝。

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