不同菌種發酵對海棠果果醋風味品質的影響

韓瑨烜，田洪磊，詹萍，程衛東

(新疆石河子大學食品科學與工程學院，新疆石河子，832000)

海棠果果醋是以海棠果為原料，經過酒精發酵和醋酸發酵，制成一種具有輕微酒精度的果醋飲料，具有促進新陳代謝，調節酸堿平衡，消除疲勞，降低膽固醇和血壓，增強肌體免疫力，防癌、抗菌消炎、美容護膚、延緩衰老、減肥等作用［1］。海棠果果醋的特點為呈現明顯的海棠果果香，營養豐富并具備果醋產品的一貫優點。

本文在前期海棠果果醋加工技術研究的基礎上，所用的樣本為不同醋酸菌發酵制得的海棠果果醋，采用模糊數學法對果醋樣本進行細致客觀的感官評定［2］，再采用固相微萃取的方法對海棠果果醋的香氣成分分別進行提取，通過氣相色譜質譜法(GC/MS)對其分析研究，得出海棠果果醋香氣中主要特征物質的成分，結合果醋感官評定的結果，嘗試揭示不同菌種發酵對海棠果果醋風味品質的影響，同時也為我國建立海棠果果醋香氣指紋圖譜提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 原料

實驗所用的果醋樣本為經過工藝優化的實驗室自釀果醋，菌種選用醋酸菌屬中具有代表性的兩大類醋酸菌，氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和巴氏醋酸桿菌(Acetobacter pasteurium)，其中，巴氏醋酸桿菌適合高溫發酵(30℃以上)，能氧化酒精產生醋酸［3］;氧化葡萄糖酸桿菌適合低溫發酵(30℃以下)，能將葡萄糖氧化為葡萄糖酸并可少量產生醋酸［4］，采用兩種醋酸菌單菌發酵和混合發酵的方式制得3支果醋作為樣本，對應的編號分別為A氧化、B巴氏、C混合。所用的醋酸菌均由石河子大學食品學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器和設備

氣相色譜-質譜聯用儀(6890GC/5973MS型)，美國Agilent公司，SPME萃取裝置，美國Supelco公司，75 μmCAR/PDMS。

1.3 果醋樣品品質分析

1.3.1 果醋樣本香氣SPME-GC/MS分析

樣品的制備:利用頂空固相微萃取(HS-SPME)裝置富集海棠果果醋香氣，操作方法為:取5 g(5 mL)左右樣品置于15 mL頂空瓶中，將老化后的75 μm Car/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250℃解吸7 min，同時啟動儀器采集數據。選用2-辛醇為內標，添加量為5 μL。

GC-MS分析條件:分流方式為不分流，色譜柱為(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序為40℃，保持3 min，以5℃/min的升溫速度升至230℃，保持7 min。載氣為He，體積流量為0.9 mL/min，進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為280℃。

質譜條件:連接桿溫度280℃，升溫程序同上，柱頭壓10 psi，電離方式EI源，電離電壓70 eV，倍增器電壓1 000 V。掃描范圍為33～450 amu。

1.3.2 果醋樣本感官分析

果醋樣本的感官分析采取模糊數學感官分析法，由10名專業評定人員組成評定小組，通過對3支果醋樣本觀察發現，3支樣本在外觀方面沒有明顯差異，測得色差和透光率的數據也幾乎一樣，所以在做感官評定時，不考慮果醋的色澤和品相，只對3支果醋的香氣和滋味這兩個屬性進行感官評定，并對香氣和滋味這兩個屬性進行細分，將香氣分為水果型香氣和發酵型香氣，將滋味分為具有海棠果原果汁風味和具有刺激性酸味。以優、好、良、差為評語集(評定標準見表1)，采用模糊數學評價方法對其進行分析，模糊關系綜合評判集Y=X·R，其中X為權重集，R為模糊矩陣。具體操作如下:

1.3.2.1 海棠果果醋因素集和評語集

因素集 U={u1，u2，u3，u4}={水果型香氣，發酵型香氣，海棠果原果汁風味，刺激性酸味};

評語集={優秀，較好，良，差};其中，優秀(91～100分)，較好(81～90分)，良(71～80分)，差(≤60分)。

1.3.2.2 權重確定

采用感官評定法確定果醋各感官指標權重分配，由10名專業評定人員對果醋中水果型香氣，發酵型香氣，海棠果原果汁風味，刺激性酸味4個指標的重要性打分，4個指標評分總和為100。評定結果見表2。

表1 海棠果果醋感官評定標準Table 1 Crabapple fruit vinegar sensory evaluation criteria

表2 權重感官評定結果Table 2 Weights sensory evaluation results

計算4個感官指標的權重，以水果型香氣為例，權重為:19/100=0.19;

同理，發酵型香氣權重:27/100=0.27;海棠果原果汁權重:17/100=0.17;刺激性酸味權重:38/100=0.38。即權重集 X={0.19，0.27，0.17，0.38}，歸一化后得權重集 X={0.20，0.30，0.15，0.35}，總和為1。

1.3.3 果醋樣本理化及微生物指標測定

總酸:堿液滴定法;總糖:斐林試劑法;pH:高精度pH計;酒精度:蒸餾法;總酯含量:蒸餾皂化法;菌落總數:≤100 CFU/mL;大腸桿菌:≤5 MPN/dL;致病微生物:不得檢出。果醋樣本理化及微生物指標見表3。

1.3.4 果醋理化及微生物指標檢測結果

表3 海棠果果醋理化及微生物指標檢測結果Table 3 Crabapple fruit vinegar physical，chemical and microbiological indicators test results

1.4 數據分析

利用隨機Xcalibue工作站NIST 2005譜圖庫標準譜庫自動檢索各組分質譜數據，結合有關文獻進行人工譜圖解析，按照內標添加量計算出各組分的相對含量(μg/mL)。只報道正反匹配均大于800的鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 感官評定結果分析

按照評價規則和標準，10位感官評定員對采用不同菌種發酵的3份果醋樣品進行細致的對比和客觀的評定，結果見表4。

根據表4中的數據可以得到3個樣品各自的模糊矩陣為 R1，R2，R3。

表4 不同菌種發酵果醋樣品的感官評定結果Table 4 Different strains fermented vinegar samples sensory evaluation results

2.2 確定模糊關系綜合評判集

同理得 Y12=0.3，Y13=0.35，Y14=0.2，得 Y1=(0.15，0.3，0.35，0.2)，從中可以得到模糊數學關系綜合評判的峰值為0.35，與原假設相比，可知A氧化的綜合評定級別為良(71～80分)。

同理可得 Y2=(0.3，0.35，0.2，0.1)，歸一化后得 Y2=(0.32，0.37，0.21，0.1)

得到模糊數學關系綜合評判的峰值為0.37，與原假設相比，可知B巴氏的綜合評定級別為好(81～90分)。

同理可得 Y3=(0.35，0.3，0.2，0)，歸一化得 Y3=(0.41，0.35，0.24，0)得到模糊數學關系綜合評判的峰值為0.41，與原假設相比，可知C混合的綜合評定級別為優秀(91～100分)。

通過模糊數學法感官評定，對比3支果醋樣本的模糊數學關系綜合評判峰值可以看出，峰值大小關系為R3＞R1＞R2，說明在感官評定中，混合發酵果醋的綜合評價最高，其次是巴氏醋酸桿菌果醋，最后是氧化葡萄糖酸桿菌果醋。從感官評定的結果看出果醋在感官品質上的區別主要體現在由發酵而產生的香氣特征方面，這些香氣特征則由香氣成分的組成、數量、感官閾值以及香氣物質之間相互協調作用決定［5］，因此僅從感官評定的結果并不能有效地體現出不同菌種發酵對果醋風味品質具體的影響，需要借助頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用(GC/MS)分析海棠果果醋香氣成分，進一步討論果醋香氣成分之間的內部聯系。

2.3 CG-MS氣質聯用技術分析結果

用頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用技術對3支海棠果果醋樣本的香氣成分進行分析，總離子流色譜圖見圖1，從3支果醋總離子流色譜圖可以看出，3支香氣成分保留時間和相對含量均存在差異，各組分質譜經計算機譜庫檢索及資料分析得出的香氣成分，結果見表5。

圖1 三支果醋樣本總離子流色譜圖Fig.1 Three vinegar sample total ion chromatogram

表5 三支果醋樣本GC/MS分析結果表Table 5 Three vinegar sample GC/MS analysis of the results

2.4 海棠果果醋香氣組成及主要香氣成分特點分析

通過表5看出，在3支果醋樣本的香氣成分中，主要以酯類、醇類、酸類、烴類、酚類和醛酮類為主，氧化葡萄糖酸桿菌發酵的果醋中共鑒定出75種香氣成分，確認匹配有32種，其中酯類(22.059 μg/mL)、醇類(22.755 μg/mL)、有機酸(8.155 μg/mL)、烴類(0.016 μg/mL)、酚類(0.137 μg/mL)、醛酮類(0.066 μg/mL);巴氏醋酸桿菌發酵的海棠果果醋中共鑒定出84種香氣成分，確認匹配有44種，其中酯類(35.66 μg/mL)、醇類(30.616 μg/mL)、有機酸(12.33 μg/mL)、烴類(0.191 μg/mL)、酚 類 (0.159 μg/mL)、醛 酮 類(0.085 3 μg/mL);采用混合發酵的果醋中鑒定出92種香氣成分，確認匹配有45種，其中以酯類(40.808 μg/mL)、醇類(31.908 μg/mL)、有機酸(18.008 μg/mL)、醛酮類(0.207 μg/mL)、烴類(0.061 μg/mL)、酚類(0.252 μg/mL)。在所有檢測出的香氣成分中，含量最為豐富的成分是酯類、醇類和酸類，其中相對含量較高的成分(＞1 μg/mg)有9種，分別是乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸，這幾個成分在 A氧化、B巴氏、C混合中均含有，分別為6、8、7種，只是含量上有差異，總相對含量分別為 48.72 μg/mg g、74.16 μg/mg、86.12 μg/mg，分別占3支果醋樣本總香氣成分的91.6%、93.8%、93.9%，其中乙酸乙酯、乙醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸在3支果醋樣本中含量均＞1 μg/mg，乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯在 B巴氏、C混合中含量 ＞1 μg/mg，B巴氏中癸酸乙酯含量＞1 μg/mg，A氧化中辛酸乙酯含量＞1 μg/mg。這些含量較高的成分很有可能決定著果醋的主要風味特征，其中，乙酸乙酯含量高且具有濃烈的水果香氣，容易揮發，故乙酸乙酯很有可能主導海棠果果醋的香氣特征;乙醇是酒精發酵階段的主要產物，乙醇本身的香氣柔和、甜潤，但是閾值較大［6］，可能對果醋的呈香起一定作用;乙酸又名醋酸，含量在3支果醋樣本中排第3，乙酸具有酸味，乙酸是果醋中酸味和刺激性口感的主要來源;少量的異戊醇具有類似于水果香和花香的氣味;苯乙醇是一種芳香烴的衍生物，具有濃郁花香味;乙酸異戊酯具有較強的類似蘋果的香味;乙酸異戊酯對海棠果果醋原果香味有一定的提升作用;乙酸苯乙酯可用于配制玫瑰香精;辛酸乙酯具有白蘭地香型香氣，用于配制食用香精;癸酸乙酯在B巴氏中含量遠高于其他兩支果醋樣品，其具有椰子香型香氣，在一定程度上可以有效提升B巴氏的果香味。由于這9種物質含量高且具有各自獨特的香氣特征，所以很可能是海棠果果醋中的主要香氣成分。

2.5 海棠果果醋香氣成分分類分析

2.5.1 酯類

酯類化合物的形成過程主要是在發酵和陳釀過程中果醋中有機酸與醇發生酯化反應形成的，在這3支果醋樣本中，除了之前提到的5種含量較高的酯類物質，3支海棠果果醋中還分別有5、10、10種酯類物質，其中，乙酸異丁酯具有柔和水果酯香味，正己酸乙酯是無色液體，有香氣，在3支果醋樣本中均含有，并在B巴氏、C混合中含量較多;肉豆蔻酸乙酯可用于食用香精、酒用香精中，壬酸乙酯具有強烈的葡萄香氣，還有果香和酒香，均只在A氧化中存在，但含量很少，對果醋香氣提升作用可能不明顯;苯乙酸乙酯有濃烈而甜的蜂蜜香氣、玫瑰花香和果香香氣，只在B巴氏、C混合中含有，含量不高，對香氣的提升作用有限;乙酸糠酯用于配制帶果香的食用香精，如飲料、糖果等，只在C混合中存在，含量較低，對香氣提升的幫助不大。總體上來看，酯類化合物在果醋中的相對含量很高，并且酯類化合物本身屬于揮發性強、氣味強烈的物質，因此酯類化合物很有可能是構成果醋香氣特征風味的主導成分。

2.5.2 醇類

醇類物質的含量在3支果醋樣本中僅次于酯類，除乙醇、異戊醇和苯乙醇外，3支果醋樣本還分別含有8、9、8種醇類物質，其中具有代表性的香氣成分有:香茅醇是最常用的香料，最適用于玫瑰香，也可作柑橘香的香精和許多香茅醇酯類的原料，在3支果醋樣本中都存在且含量相似，可以起到給果醋增香的作用;金合歡醇只在 B巴氏、C混合中含有，其主要用作丁香、玫瑰等花香韻香精的調合料，也有一定增香的功能。雖然醇類在果醋中含量很高，但真正具有香氣特征的成分并不多，由于醇類都是果醋酒精階段發酵或者蛋白質水解過程中氨基酸脫羧而形成的產物［7］，故醇類物質的存在除了提供給果醋一個圓潤的口感外，在香氣特征方面的影響較酯類物質要小。

2.5.3 酸類

酸類物質含量在果醋中排第3，其中醋酸的生成是果醋生產的主要環節。從乙醇氧化為醋酸分為兩個階段:由乙醇在乙醇脫氫酶的催化下氧化成乙醛，再由乙醛吸水形成乙醛水化物，接著由醛脫羧酶氧化成醋酸，由于樣品果醋未經過后熟，各種反應并不發生完全，經過后熟之后，酸類物質的含量可能還會有所上升。其他酸類物質如9-癸烯酸、異丁酸、辛酸，在3支果醋樣本中均存在，9-癸烯酸呈顯著脂肪酸和蠟香，略有果香和乳香;異丁酸具有香味，可用作食用香料;辛酸具有香味，是允許使用的食用香料。另外在B巴氏、C混合中還含有月桂酸，具有月桂油香味。酸類物質一般都具有較為強烈的刺激性口感，果醋中酸類成分對香氣的提升遠不如其對果醋口感的影響。

2.5.4 醛酮類及烴類

醛酮類在3支果醋樣本中分別只有2、6、5種，總含量也分別只有 0.066 μg/mL、0.085 3μg/mL、0.207 μg/mL，其中3-羥基-2-丁酮和5-甲基呋喃醛在 B巴氏、C混合中均含有，前者呈現甜樣的焦糖氣味并帶有果甜味，后者可作為煙用香精;壬醛在含量較低的情況下呈現濃郁的花香味，在3支果醋樣本中都含有，但在C混合中較多;突厥酮和香葉基丙酮只在C混合中含有，前者具有甜的果香、青香、花香、木香和漿果香氣，后者可用于食品香精;仲辛酮、糠醛和十八醛只在B巴氏中含有少量，其中仲辛酮可作為食品香料，糠醛具有焦香氣味和甜樣焦糖氣味，十八醛具有椰子型香氣，略有茴香音韻，稀釋后有杏、李子香氣;烴類只有三氯甲烷這1種物質，三氯甲烷易揮發，味辛甜并有特殊芳香氣味，在3支果醋樣本中均含有，可以看出，醛酮類及烴類物質雖然含量不高，種類較少，但是這些物質卻極具香氣特征，它們可能在一定程度上會增加或者輔助海棠果果醋的主體香氣［8］。

2.5.5 酚類

3支果醋樣本中檢測出并符合條件的酚類物質只有兩種，分別為丁香酚和對乙烯基愈瘡木酚，其中丁香酚有強烈的丁香香氣，可用于香水香精以及各種化妝品香精和皂用香精配方中，還可以用于食用香精的調配;對乙烯基愈瘡木酚有特殊芳香氣味，可用作生產香料，3支果醋樣本中均含有這兩種物質，C混合中含量較多，可以看出，這兩種物質雖然含量較少，但是香氣特征明顯，很可能對果醋的主體香氣具有輔助作用。

3 結論

(1)采用模糊數學法對不同菌種發酵的海棠果果醋進行感官評定，其中模糊數學綜合評定峰值大小為:R3＞R1＞R2;最后的感官評定結果為:A氧化的綜合評定級別為良(71～80分)，B巴氏的綜合評定級別為好(81～90分)，C混合的綜合評定級別為優秀(91～100分)。

(2)采用GC-MS氣質聯用技術分析了3種海棠果果醋的香氣成分，發現海棠果果醋中香氣成分種類非常豐富，主要有醇類、酯類、有機酸類、雜環類化合物、烴類以及酚類等，通過對3種果醋中的有效香氣成分進行分析發現，相對含量較高(＞μg/mg)的成分均為酯類、醇類或者酸類，總含量均占3支果醋樣本香氣成分總含量的90%以上，可以推斷，這些物質可以看作是海棠果果醋的主要香氣成分，這些物質共同構成了海棠果果醋的主體香氣，其他含量較少的物質也在一定程度上增加或輔助了海棠果果醋的香氣特征，正是由于這些物質之間協同作用、共同協調，才形成了海棠果果醋獨特的風味品質。

(3)不同菌種發酵對海棠果果醋的風味品質確實有明顯的影響，通過GC/MS分析，知其原因很可能與不同醋酸菌發酵過程中形成的產物在種類和含量上不同有關，其中有些物質通常具有獨特的香味或者可以輔助其他物質發揮出香氣，這從根本上決定了不同菌種發酵的海棠果果醋在風味品質上的差別，巴氏醋酸桿菌由于醋酸和酯類的轉化率高，所以制得的果醋在感官上要好于采用氧化葡萄糖酸桿菌發酵的果醋，而這兩種醋酸菌混合發酵制取的海棠果果醋無論是理化檢驗指標和感官評定結果，還是物質利用率、產物轉化率以及發酵效率，相比單菌發酵都有明顯提高，與同類的市售果醋飲料相比也具有一定的優勢。

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