白鰱中鹽溶蛋白提取工藝優(yōu)化及其加工特性研究*

雷頌，竇建洲，梅志方，楊品紅，王伯華

(湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，湖南常德，415000)

我國淡水魚產(chǎn)量穩(wěn)居世界高位，并保持每年5%的增長勢頭。但目前我國淡水魚資源浪費嚴重，產(chǎn)品開發(fā)利用與加工水平不高，淡水魚的加工利用只占到總魚量5%左右，而且其中絕大多數(shù)為冷凍冷藏及冰鮮品，深加工產(chǎn)品僅占很小的一部分［1］。鰱魚，四大家魚之一，又名白鰱，屬于鯉形目，鯉科。白鰱新鮮食用因其具有土腥味、骨刺多，銷路受到局限，經(jīng)濟效益低其附加值還沒有真正完全發(fā)掘出來。

鹽溶蛋白(salt soluble proteins，SSP)又稱肌原纖維蛋白［2］，是肌肉中最重要的蛋白質(zhì)，是決定肉制品品質(zhì)的最主要的蛋白，約占總蛋白含量的50% ～60%。研究表明鹽溶性蛋白性質(zhì)對魚肉的保水性、膠凝性等加工特性影響甚大［3］。鹽溶性蛋白質(zhì)中的幾種重要蛋白質(zhì)如肌球蛋白、機動蛋白及機動球蛋白的凝膠機理已研究的較為清楚。目前，對豬肉、牛肉、雞肉以及海水魚的鹽溶性蛋白做了較為詳細的研究，而針對淡水魚鹽溶性蛋白熱誘導(dǎo)凝膠保水性及其乳化性等加工特性的研究相對較少。深入研究白鰱鹽溶蛋白的功能性質(zhì)能促進白鰱的深加工和新產(chǎn)品開發(fā)，創(chuàng)造營養(yǎng)價值高、安全天然的食品，提高白鰱的附加值、改善鮮銷壓力大的狀況具有重要的意義。

本試驗以鮮活鰱魚為研究對象，優(yōu)化其鹽溶蛋白提取條件，并對鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠保水性以及鹽溶蛋白乳化性等加工特性進行研究，并探討其用作高檔天然肉糜制品品質(zhì)改良劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗原料及主要試劑

鮮活白鰱，購自生鮮市場(質(zhì)量在1～1.25 kg/條);一級大豆油，購自嘉里糧油(深圳)有限公司。

NaOH、NaCl、KI、CuSO4·5H2O、四水合酒石酸鉀鈉、HCl、Na2HPO4、NaH2PO4、三聚磷酸鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，均為分析純;標準牛血清白蛋白，北京馳明瑞生物科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)，生興生物技術(shù)(南京)有限公司，分析純。

1.2 實驗設(shè)備

LD4-2A低速離心機，北京醫(yī)用離心機廠;JJ-2組織搗碎勻漿機，富華儀器有限公司;DELTA320 pH計，梅特勒-托麗多儀器(上海)有限公司;AL204電子分析天平，梅特勒-托麗多儀器有限公司;C12型絞肉機，廣東省韶關(guān)市新通力食品機械有限公司;BCD-257SL冰箱，青島海爾股份有限公司;721N可見光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司;ULTRA-TURRAX T25型高速分散儀，IKA儀科有限公司。

1.3 實驗方法

鹽溶蛋白的提取:取鰱魚背肉，剔出紅色肉，用絞肉機絞碎，稱取每份25 g，真空包裝后在-18℃下凍結(jié)，備用。提取鹽溶蛋白時，先將冷凍樣品在4℃下解凍，加入4倍質(zhì)量0～4℃的蒸餾水，用高速組織搗碎機勻漿(6 000 r/min，5 min)。再轉(zhuǎn)入離心管中，離心(3 000 r/min，10 min)，去除上清液，重復(fù)1次，向沉淀中加入不同提取條件的 NaCl溶液，勻漿液在4℃靜置25 h后，紗布初濾，濾液經(jīng)(4 000 r/min，30 min)后得到上層溶液即為鹽溶蛋白質(zhì)溶液。

單因素試驗:在固液比為1∶4(g∶mL)、提取液pH值為6.5、浸提時間為25 h的條件下，設(shè)置鹽濃度(mol/L)0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 七個梯度進行試驗，測定鹽濃度對鹽溶蛋白得率的影響;在NaCl濃度為0.6 mol/L、提取液 pH值為6.5、浸提時間為25 h的條件下，設(shè)置固液比(魚肉與添加溶液的比例，g∶mL)1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 五個梯度進行試驗，測定固液比對鹽溶蛋白得率的影響;在NaCl濃度為 0.6 mol/L、固液比1∶4、提取液 pH為6.5的條件下，設(shè)置浸提時間為5、10、15、20、25、30六個梯度進行試驗，測定浸提時間對鹽溶蛋白得率的影響;在NaCl濃度為0.6 mol/L、固液比1∶4、浸提時間為 25 h，設(shè)置浸提 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0五個梯度進行試驗，測定浸提 pH對鹽溶蛋白得率的影響。

提取工藝的優(yōu)化:采用正交試驗法，通過以上單因素實驗設(shè)計出正交試驗如表1所示。

表1 正交因素實驗水平Table1 Factors and levels for the orthogonal test

蛋白質(zhì)含量的測定采用雙縮脲法，以BSA(牛血清白蛋白)作為標準蛋白。

鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的制備及保水性的測定采用于巍［1］等的方法略作修改:先稱離心管質(zhì)量(m)，取鹽溶蛋白提取液10 mL置于干凈離心管中制備凝膠，在4℃下保存24 h，稱離心管和凝膠質(zhì)量m1，然后將凝膠在3 000 r/min、4℃下離心5 min，稱傾去水分后的離心管和凝膠的質(zhì)量m2，則:

鹽溶蛋白乳化性的測定參考郭玲［4］的方法略作修改:取一定量的鹽溶蛋白提取液調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度為1%，將鹽溶蛋白提取液與大豆油按體積比3∶1的比例混合，在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下乳化1 min后立即倒入小燒杯中，在杯底取50 μL的乳化液加入到5 mL的0.1%SDS(十二烷基磺酸鈉)中，充分搖勻后在波長500 nm處測定吸光度，重復(fù)4次。乳化活力指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)用如下公式計算:

式中:A0，后迅速被稀釋的乳化液的吸光度;Φ，油相體積分數(shù)(V/V，φ=0.25);c，蛋白質(zhì)量濃度，g/mL;A10，乳化液在靜置10 min后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量標準曲線

由圖1可知，雙縮脲法測定鹽溶蛋白含量的標準曲線為y=0.039x+0.008 1，其R2=0.999，具有較好的擬合度，可用于鹽溶蛋白乳化性測定中蛋白濃度的調(diào)整。

圖1 蛋白質(zhì)含量標準曲線Fig.1 Protein content standard curve

2.2 鹽濃度對鹽溶蛋白得率的影響

由圖2可知，其他因素固定不變條件下，提取液的鹽溶蛋白得率隨著鹽濃度的提高而增加，說明鹽濃度在0.2～0.7 mol/L內(nèi)，較高的鹽濃度能提高鹽溶蛋白的浸出率;鹽濃度在0.7 mol/L以上，提取液的蛋白濃度變化不大，尤其在0.5和0.6 mol/L濃度時，提取液蛋白得率基本不變，0.8 mol/L提取濃度時得率稍有下降，表明在鹽濃度在0.7 mol/L時，基本上將可溶的鹽溶蛋白提出。因此，鹽濃度0.7 mol/L是最優(yōu)的選擇，后續(xù)試驗采取鹽濃度0.7 mol/L。

圖2 鹽濃度對鹽溶蛋白得率的影響Fig.2 Effects of salt concentration on salt soluble proteinyield

2.3 固液比對鹽溶蛋白得率的影響

由圖3可知，提取液的鹽溶蛋白得率隨著固液比的增加而增加，從1∶3到1∶4之間增幅顯著，而后增幅緩慢。在要求提取液的鹽溶蛋白濃度和得率盡可能高的情況下，固液比1∶4為最優(yōu)，后續(xù)試驗采用鹽濃度 0.7 mol/L，固液比1∶4。

圖3 固液比對鹽溶蛋白得率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on salt soluble protein yield

2.4 浸提時間對鹽溶蛋白得率的影響

從圖4可以看出，提取液中蛋白含量隨著浸提時間的增加而增加，在25 h以前，隨時間的延長蛋白含量增長幅度較大;25 h以后，隨浸提時間的延長蛋白質(zhì)含量增長幅度很小。這表明，浸提25 h左右，鹽溶蛋白基本上都已溶出，如果時間過長，蛋白性質(zhì)會發(fā)生變化，不利于后期試驗，綜合考慮25 h是最佳的浸提時間，后續(xù)試驗采取鹽濃度0.7 mol/L、固液比1∶4、提取時間為25 h。

圖4 時間與鹽溶蛋白得率的關(guān)系Fig.4 Effects of extraction time on salt soluble protein yield

2.5 浸提液pH值對鹽溶蛋白得率的影響

從圖5可以看出，隨著pH值的改變，鹽溶蛋白得率的變化幅度非常大，表明pH值的變化對鹽溶蛋白的提取的影響很大。pH值從5.0到6.5，鹽溶蛋白得率迅速升高，pH為6.5時鹽溶蛋白得率最高，達到12%;pH 6.5以后，得率開始下降。這與 Westphalen［5］和 Lesiow［6］的研究結(jié)果類似。

圖5 pH與鹽溶蛋白得率的關(guān)系Fig.5 Effects of pH on salt soluble protein yield

2.6 鹽溶蛋白提取工藝正交優(yōu)化

由表2和表3可以看出，最后確定鹽溶蛋白提取的最佳工藝條件為:A1B3C3D3，即提取液中NaCl濃度為0.8 mol/L、固液比為1∶5、提取液 pH 為6.0、浸提時間為30 h。在這4個因素中，影響大小順序是B＞C＞D＞A，即鹽濃度影響最大，其次是固液比和提取時間，pH值影響最小;浸提時間和pH值影響相對較小。最佳工藝參數(shù)組合A1B3C3D3出現(xiàn)在正交表中即實驗3，在此最佳條件下鰱魚背肉鹽溶蛋白得率為12.66%，提取效果最好。優(yōu)于劉安軍［7］研究中鱈魚鹽溶蛋白的最佳提取率。因此，后續(xù)實驗提取條件為NaCl濃度為0.8 mol/L、固液比 1∶5、提取液pH值為6.0、浸提時間為30 h。

表2 正交試驗表Table 2 Results of the orthogonal test

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Variety analysis of the results

2.7 溫度對白鰱鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠保水性的影響

從圖6可以看出，隨著處理溫度的升高，保水性升高，在 80℃ 時保水性達到最大值，最大值為98.24%，90℃ 時保水性逐漸下降。這可能是由于:一是溫度升高后，水分子的運動加劇，加快了蛋白質(zhì)的吸水速度;二是在熱作用下，某些處于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的極性側(cè)鏈轉(zhuǎn)而朝向蛋白質(zhì)表面，進而提高了蛋白質(zhì)的親水性［8］。從結(jié)果可知，以保水性為依據(jù)，80℃為白鰱鹽溶蛋白最佳凝膠溫度，即后續(xù)試驗采用鹽溶蛋白熱凝膠溫度為80℃。

圖6 溫度對鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Fig.6 Effects of temperature on salt soluble protein’s WHC

2.8 不同提取助劑對白鰱鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠保水性的影響

由圖7可知，空白對照組的鹽溶蛋白熱凝膠保水性最低，添加磷酸鹽對鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的保水性均有提升作用，其中濃度0.1 mol/L的磷酸緩沖液［9］保水性最高，最高為96.61%，濃度為0.01 mol/L的三聚磷酸鈉溶液［10］效果次之。這是由于肌肉蛋白在pH值約5.4的等電點時保水性最差，添加磷酸鹽可將肉制品的pH值提高到6.0～6.4。磷酸鹽改變蛋白質(zhì)電荷電勢使蛋白質(zhì)之間互相排斥，從而產(chǎn)生更大的空間容納更多水分，提高肉的保水性［2，11］。而磷酸緩沖液對凝膠保水性的提升效果優(yōu)于三聚磷酸鈉，可能是由于磷酸緩沖液的離子強度較高，更利于鹽溶蛋白的溶解，因而凝膠保水性得以增強［12］。

圖7 不同提取助劑對鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Fig.7 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s WHC

2.9 白鰱鹽溶蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性

由表4可知，白鰱鹽溶蛋白的 EAI為19.47 m2/g，ESI為 89.50%，優(yōu)于董哲［13］文章中相同離子條件下草魚鹽溶蛋白的EAI和ESI。白鰱鹽溶蛋白的EAI、ESI的標準差均較小，具有較好穩(wěn)定性，偏差較小。由此可見，白鰱鹽溶蛋白具有較好乳化能力，能夠較好改善肉糜制品加工質(zhì)量。

表4 鹽溶蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性Table 4 EAI and ESI of salt soluble protein

2.10 不同提取助劑對白鰱鹽溶蛋白乳化活性與乳化穩(wěn)定性的影響

由圖8可知，空白對照組白鰱鹽溶蛋白 EAI 最低，添加磷酸緩沖液及三聚磷酸鈉對白鰱鹽溶蛋白EAI均有較大提高，其中以三聚磷酸鈉提升作用最大，最大為19.52 m2/g，磷酸緩沖液次之。這可能是由于磷酸鹽提高了魚肉蛋白質(zhì)的離子強度，改變了魚肉的pH值，影響了蛋白質(zhì)分子疏水基團的分布情況，使得乳化活性提高。這與楊玉玲等［14］報道的 pH和離子強度是影響鹽溶蛋白的極顯著因素相符。

圖8 不同提取助劑對鹽溶蛋白的乳化活性(EAI)的影響Fig.8 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s EAI

由圖9可知，添加磷酸緩沖液對白鰱鹽溶蛋白ESI有所改善，其穩(wěn)定性最高，最高為97%，而三聚磷酸鈉則使白鰱鹽溶蛋白ESI降低。這可能是由于磷酸鹽緩沖液對鹽溶蛋白乳濁液體系的pH具有較高的穩(wěn)定性，進而提高了乳化穩(wěn)定性。綜合比較磷酸緩沖液、三聚磷酸鈉對白鰱鹽溶蛋白EAI和ESI的影響，添加磷酸鹽緩沖液能較好提升白鰱鹽溶蛋白乳化能力。

圖9 不同提取助劑對鹽溶蛋白的乳化穩(wěn)定性(ESI)的影響Fig.9 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s ESI

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了白鰱魚肉鹽溶蛋白的提取工藝參數(shù)，結(jié)果表明 NaCl濃度為0.8 mol/L、pH值為6.0、浸提時間為30 h、固液比為1∶5時，鰱魚魚背肉鹽溶蛋白最大提取濃度為2.602 4 g/100 g。通過對白鰱鹽溶蛋白的加工特性研究，發(fā)現(xiàn)其保水性可達98.24%，乳化活性最大為19.47 m2/g，乳化穩(wěn)定性最大為89.45%，具有較好的凝膠保水性及乳化能力，可有效改善肉糜制品加工品質(zhì)。

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