不同酵母與溫度發酵的威代爾冰葡萄酒有機酸分析*

唐柯，王蓓，馬玥，徐巖，李記明

1(食品科學與技術國家重點實驗室、工業生物技術教育部重點實驗室、江南大學生物工程學院釀酒微生物與酶技術研究室，江蘇無錫，214122)2(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東煙臺，264000)

有機酸是葡萄酒中重要的組成成分之一，葡萄酒中的有機酸主要來源于葡萄果實(蘋果酸、酒石酸、檸檬酸)以及發酵過程(乳酸、乙酸、琥珀酸)［1］。有機酸是葡萄酒中重要的呈味物質，是葡萄酒酸度的主要決定因素。有機酸的種類、含量和比例調節著葡萄酒的酸堿平衡，影響著葡萄酒的口感、色澤及生物穩定性［2］。

冰葡萄酒是采用特殊釀造工藝釀造的葡萄酒。它是將葡萄推遲采收，在-8℃的氣溫下，果實掛在枝頭通過自然結冰和風干，葡萄中的糖分得到高度濃縮，在結冰的狀態下壓榨、低溫保糖發酵釀制而成的甜型葡萄酒(VQA，1999)。釀造冰酒的過程十分緩慢，經常要花費數個月才能達到期望的酒精含量。在如此長時間發酵期內，保持其發酵安全性和品質的優異，口感的協調至關重要，因此冰酒發酵對酵母和發酵溫度的選擇具有特殊性。酵母種類對冰酒發酵過程中乙酸和甘油形成、發酵速度和冰酒的感官特性有顯著的影響［3］。由于冰葡萄汁的含糖量高，黏度大，高糖引起的高滲透脅迫會產生一定量的乙酸，而使酒的揮發酸含量高于一般的葡萄酒［4］。因此，冰酒發酵過程的重點是保持果香，形成優雅的酒香和醇和的口感，控制揮發酸的含量。主要措施就是選擇適宜的酵母菌和控制發酵溫度。加拿大科學家在冰酒發酵過程中選擇了7個商品酵母進行試驗，結果發現酵母ST、N96和EC1118對香氣和乙酸的控制最好，適合釀造冰酒［5］。Pigeau等研究了含糖量高于40°Brix的冰葡萄汁對酵母發酵的影響，結果表明隨著冰葡萄汁含糖量的增加，發酵過程中產生了更多的乙酸和甘油，并且酵母生長速率和乙醇生成量都有所降低［6］。邵威平的研究發現，冰葡萄酒發酵溫度為5℃時，酵母活性受到很大抑制;當發酵溫度高于10℃時，隨著溫度的升高，發酵原酒的酒度和揮發酸明顯增高，總糖、干浸出物和氨基酸含量減少，削弱了冰酒甜潤醇厚的典型性［7］。

我國作為世界上僅有的幾個能釀造冰葡萄酒的國家，冰酒資源優勢非常明顯。但是目前國內對冰葡萄酒的研究仍相對較少，而且當前的研究更多的集中于冰葡萄酒的釀造工藝及香氣分析［8-10］，對于冰葡萄酒品質具有重要影響的有機酸的系統研究還尚未見報道。本文以不同釀造條件的冰葡萄酒為研究對象，通過高效液相色譜分析不同酵母不同發酵溫度對冰葡萄酒有機酸含量的影響，為進一步改進冰葡萄酒釀造工藝，提高我國冰葡萄酒品質提供科學參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料:選用遼寧省桓仁地區產2011年份威代爾葡萄，采收時糖度為32°Brix。

酵母:EC、R2、K1、ST，白香郁均由張裕葡萄酒公司提供。

試劑:草酸、酒石酸、甲酸、丙酮酸、L-蘋果酸、莽草酸、L-抗壞血酸、L-乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸等12種有機酸標樣購自Sigma-Aldrich公司，純度均在99%以上。

1.2 儀器與設備

pH計，METTLER TOLEDO;恒溫烘箱，上海實驗儀器廠有限公司;循環水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市子華儀器有限責任公司;純水儀，Millipore Simplicity UV Bedford，MA，USA;安捷倫液相色譜儀1200配有紫外檢測器，美國安捷倫公司。

1.3 標準溶液的配制

分別精確稱取草酸等12種有機酸0.2～0.8 g，用甲醇溶解并轉移置10 mL棕色容量瓶中，用流動相定容至刻度，封口，作為標準貯備液，在-20℃保存備用。使用前，根據實驗需要將此標準貯備液用流動相稀釋至適宜含量，以配制標準工作液和混合標準工作液。

1.4 色譜條件

參照段云濤(2007)的方法［14］，略有改動。WATERS Atlantis T3色譜柱(4.6 mm×150 mm ID，3 μm);保護柱為 PhenomeneX RP-C18Security Guard(4.0 mm×3.0 mm)，紫外檢測波長為210 nm，柱溫30℃，進樣量為10 μL，以峰面積外標法定量。

等度洗脫:流動相為:10 mmol/L NaH2PO4，pH 2.7;流速為0.8 mL/min。

冰葡萄酒樣品與流動相按照1∶9(v/v)進行稀釋，測定前經0.45 μm水相微孔濾膜過濾。

1.5 試驗方法

分別在10，15，20 ℃三個溫度下，接種 EC、R2、K1、ST和白香郁5種釀酒酵母進行發酵，酵母接種量統一為1×106個細胞/mL，發酵工藝參照文獻［8］。發酵設備采用50 L不銹鋼發酵罐，每個處理各發兩罐。3個溫度下5種釀酒酵母發酵的冰葡萄原酒的理化指標數據見表1。

1.6 數據處理

所有實驗均重復3次，數據處理與統計分析采用SPSS 19.0分析軟件進行，繪圖采用SigmaPlot 12.1進行。

2 結果與分析

2.1 定性

將酒石酸、琥珀酸、乙酸、丙酮酸、草酸、L-蘋果酸、L-乳酸、檸檬酸、L-抗壞血酸、甲酸、莽草酸和馬來酸共計12種標準品配成混合樣品，用增高法定性。結果表明，12種有機酸標準品在上述色譜條件下，能夠充分分離，并且峰型銳利，分離效果較好(見圖1)。

表1 不同處理條件發酵的威代爾冰葡萄原酒的理化指標Table 1 Characteristics of Vidal ice wine produced by different fermentation conditions

圖1 12種有機酸標樣色譜圖(a)及冰酒樣品色譜圖(b)Fig.1 Chromatogram of twelve organic acids from a standard mixture(a)and an icewine sample(b)by HPLC

2.2 不同釀造方式對冰葡萄酒總有機酸含量的影響

對不同酵母及不同發酵溫度發酵的冰葡萄酒樣品中12種有機酸含量的測定結果見表2。從表2中可以看出，在所有冰酒樣品中均檢測到了除甲酸及抗壞血酸外的10種有機酸。在這10種有機酸中，蘋果酸的含量最高，約占總有機酸的50%左右，其次乙酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸的含量也較高。馬來酸的含量最低，平均只有0.002 g/L左右。從總量上來看，20℃ R2酵母發酵的冰葡萄酒有機酸含量最高，達到14.515 g/L，而EC在10℃下發酵的含量最低，只有12.472 g/L。

酒石酸、蘋果酸與檸檬酸是葡萄果實中自然形成的3種有機酸，也是葡萄酒中的3種固有酸;琥珀酸，乳酸，乙酸則是來自于發酵過程。通常，在葡萄酒中主要的有機酸類物質是酒石酸、蘋果酸與檸檬酸［11］。Kritsunankul等人研究發現，高質量的葡萄酒往往含有較高來自葡萄果實的有機酸，而含有較低發酵過程中產生的有機酸［12］。從表2中可以，在不同酵母、不同溫度下發酵的冰酒樣品中酒石酸、蘋果酸與檸檬酸的含量均較高。此外，因為發酵后的冰酒樣品均未經過蘋果酸-乳酸發酵，所以蘋果酸在冰酒有機酸的含量很高，占到了總有機酸的50%左右，而乳酸的含量則非常低。影響葡萄果實中蘋果酸含量最主要的因素是氣候，較冷環境收獲的葡萄果實中蘋果酸含量更高［13］。冰葡萄后熟期環境溫度較低，因此冰葡萄中蘋果酸含量比普通葡萄果實更高。段云濤等人的研究中，3款來自加拿大的冰酒中蘋果酸的含量范圍為4.873～5.192 g/L，本實驗蘋果酸含量范圍為6.225～6.855 g/L，略高于其檢測值［14］。

琥珀酸是葡萄酒發酵過程中產生的一種重要的有機酸，琥珀酸的味感復雜，既酸又苦，也是葡萄酒所含有機酸類中最富于味覺反應的一種酸。根據Castellari等人的研究，耐冷凍沉淀、非耐冷凍沉淀酵母發酵葡萄酒中琥珀酸含量分別為1.090 g/L、0.530 g/L，可以看出不同酵母發酵會導致琥珀酸含量有較大差異［15］。Aragon等對不同釀造溫度葡萄酒有機酸含量變化展開研究，葡萄酒琥珀酸含量范圍為1.03～1.33 g/L，其含量變化與發酵溫度沒有明顯聯系［16］。從本研究中結果看，琥珀酸含量與發酵溫度也無明顯聯系。

表2 不同處理條件發酵的威代爾冰葡萄原酒中有機酸含量 (n=3) 單位:g/LTable 2 The content of organic acids in Vidal ice wine produced by different fermentation conditions(n=3)

2.2.1 不同酵母對冰酒有機酸含量的影響

從圖2中可以看出，在10℃的發酵溫度下，EC、K1和ST產生的有機酸含量較低，白香郁有機酸含量最高;在15℃的發酵溫度下，同樣是ST產生的有機酸含量最低，EC和K1含量較高，兩者之間并無顯著性差異;在20℃的發酵溫度下，ST與白香郁的有機酸含量較低，而R2有機酸含量最高。綜合來看，ST在3個溫度下產生的有機酸含量在5個酵母中都相對較低。

2.2.2 不同發酵溫度對冰酒有機酸含量的影響

圖3是不同發酵溫度發酵冰葡萄酒的總有機酸含量。從圖3中可以看出，5種酵母在3個不同發酵溫度下對有機酸的影響不完全相同。在用EC1118、R2、K1、ST四種酵母釀造的冰酒中，總有機酸含量隨溫度升高而增加。而白香郁酵母釀造冰酒總有機酸含量的變化趨勢則與其他4種酵母有所不同，其釀造溫度為10℃時，總有機酸含量最高。綜合來看，較低的溫度有利于控制有機酸含量的生成。

圖2 不同酵母發酵冰葡萄酒有機酸含量Fig.2 The content of organic acids fermented with different species of yeast strains

圖3 不同發酵溫度發酵冰葡萄酒有機酸含量Fig.3 The content of organic acids fermented with different temperature

2.3 不同釀造方式對冰葡萄酒乙酸含量的影響

從表2可以看出，在不同溫度不同酵母發酵的15個冰酒樣品中，乙酸含量最高的是20℃ R2酵母發酵的冰酒樣品，達到2.488 g/L;最低的是10℃下ST酵母發酵的冰酒樣品，乙酸含量只有1.316 g/L。此外，在不同發酵溫度下乙酸與總有機酸含量變化趨勢基本一致，釀造溫度越高，乙酸含量越高，較低的發酵溫度有利于對乙酸的控制;而不同酵母發酵的冰酒樣品中，ST對乙酸的控制最好，乙酸生成量最低。

乙酸是葡萄酒釀造過程的“晴雨表”，其含量的高低直接影響到葡萄酒的品質。由于冰葡萄汁的高糖濃度作用于酵母細胞壁后，會形成過高的滲透壓，使酵母代謝異常，一方面使得發酵過程通常要達到數月才可以達到期望的酒精度，另一方面高糖導致的高滲透壓會形成大量的揮發酸，其中最主要是乙酸［4］。較低濃度的乙酸對冰酒質量不會產生很大影響，乙酸在乙醇乙酰基轉移酶的作用下和乙醇生成乙酸乙酯，它會給葡萄酒帶來一定的果香味，但是高濃度的乙酸會對葡萄酒的風味產生較大影響。在加拿大，VQA(1999)關于冰酒中揮發酸的限定是最高不超過2.1 g/L。而Cliff等的研究發現，冰酒中乙酸的閾值是3.185 g/L，通常絕大多數冰酒中的乙酸含量都不會超過這個值［17］。最近一項對于加拿大冰酒的調查研究發現，在加拿大冰酒中乙酸含量范圍很大，在0.49～2.29 g/L之間，但是平均水平在1.3 g/L左右，還是遠遠低于冰酒中乙酸的感覺閾值，不會對冰酒的風味帶來較大影響［18］。表2結果可以看出，在3個溫度、5個酵母發酵的15款冰酒樣品中，檢測到的乙酸在1.316～2.488 g/L之間，同樣遠低于3.185 g/L的閾值水平。

2.4 雙因素方差分析

為了進一步考察發酵溫度及酵母與乙酸含量之間的關系，我們通過雙因素方差分析對其進行判斷。表3是各主體間效應檢驗表及方差分析表，從各項顯著性檢驗的P值來看，截距上溫度與酵母對乙酸含量的影響，在0.05的顯著性水平上是非常顯著的，說明無論發酵溫度還是不同的酵母對冰酒發酵產生的乙酸都有很大的影響。

表3 主體間效應的檢驗表及方差分析表Table 3 Tests of between-subjects effects

表4是不同溫度對乙酸含量多重比較的結果，從顯著性檢驗的結果來看，3個發酵溫度兩兩之間都是具有顯著差異的，說明3個不同的發酵溫度之間乙酸含量差異很大。

表4 不同溫度對乙酸含量多重比較結果Table 4 Themultiple comparisons of different temperature

表5是不同酵母對乙酸含量的多重比較結果，從分局顯著性檢驗的結果來看，在不同酵母發酵冰酒產生乙醇含量之間，除了酵母EC與R2，EC與K1差異不顯著外，剩余不同酵母之間差異都是極顯著的。

表5 不同酵母對乙酸含量多重比較結果Table 5 Themultiple comparisons of different yeast strains

3 結論

本文采用HPLC分析技術測定了不同溫度不同酵母釀造的威代爾冰葡萄酒中12種主要的有機酸，結果表明，在所有冰葡萄酒樣品中均檢測到了除甲酸和抗壞血酸外的10種有機酸，其中蘋果酸含量最高，酒石酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸的含量也比較高，其他有機酸含量基本都小于1 g/L，馬來酸含量最低，平均只有0.002 g/L。總有機酸含量隨釀造溫度升高而增加。較低的發酵溫度有利于對乙酸的控制。ST酵母在不同發酵溫度下乙酸含量均較低。

通過雙因素方差分析的統計學方法，對不同酵母不同溫度下發酵的15款冰葡萄酒中的乙酸含量進行分析。結果表明，無論發酵溫度還是酵母種類對冰酒發酵產生的乙酸都有極顯著地影響;3個不同的發酵溫度之間乙酸含量差異很大;在不同酵母發酵冰酒產生乙酸含量之間，除了酵母EC與R2，EC與K1差異不顯著外，剩余不同酵母之間差異都是極顯著的。

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